Резюме об экспериментах генома

↑

▷ Содержание

⇐ ПредыдущаяСтр 10 из 20Следующая ⇒

ВИЧ-геном in vitro

Первоначальное действие при идентификации ДНК или РНК организма не является технологией клонирования и программирования (упорядочивания). Сотрудник полиции, желающий узнать, принадлежит ли ДНК, собранная на месте преступления, к подозреваемому, должен получить от этого лица пероральный тампон (клетки и отсюда ДНК). И впоследствии закон требует доказательной цепи, доказывающей, что источником ДНК является лицо, идентифицированное как подозреваемый. Как это есть с людьми, так это есть и с ретровирусами. Чтобы определить геном ретровируса, должно быть доказано, что существует ретровирус и нуклеиновая кислота поступает из этого ретровируса. Другими словами, учёный должен извлекать и упорядочивать (программировать) РНК из очищенных ретровирусных частиц. Тогда РНК может быть не чем иным, как ретровирусным геномом. Однако ни Монтанье, ни Галло, ни какой-либо другой исследователь по ВИЧ не определили геном «ВИЧ» таким образом.

Галло и его коллеги были первыми учёными, которые проводили эксперименты по определению генома ВИЧ. Его методы и данные приводятся в трёх статьях, опубликованных 31 августа, 8 ноября и 7 декабря 1984 г.^14-16. Факты Галло предлагают наиболее подробный пример, опубликованный для существования генома «ВИЧ», и из-за его важности мы сначала обобщим его данные, прежде чем подробно обсудим каждую деталь.

Целью исследований генома Галло было решение четырёх задач: определить ВИЧ-геном; доказать, что он выполнил цикл ретровирусной репликации; клонировать геном; и доказать, что вирус является экзогенным. Экзогенным ретровирусом является тот, который приобретается извне, то есть вне клетки. Как уже упоминалось, «эндогенный ретровирус» является термином, используемым для обозначения присутствия последовательностей, сходных с ретровирусными геномами ДНК человека, которые не проявляются как инфекционные частицы. Говорят, что такие последовательности занимают 8% генома человека.^{49, 50}

1. Идентификация ВИЧ-генома

Супернатант из «инфицированных» H9-культур, находящийся в полосе градиента плотности сахарозы, без каких-либо электронно-микроскопических доказательств, что он содержал ретровирусноподобные частицы, материал из полосы 1,16 г/мл был объявлен очищенным ВИЧ. Поли(А) РНК, экстрагированная из полосы 1,16 г / мл, затем была объявлена как ВИЧ-геном. Поли(А) РНК не является специфичной для ретровирусов (см. ниже).

2. Доказать, что ВИЧ удовлетворяет ретровирусному циклу репликации

Цикл ретровирусной репликации состоит из четырех шагов:

(а) ретровирусные частицы, присутствующие в супернатанте культуры, поглощаются неинфицированными клетками;

(b) внутри цитоплазмы ретровирусная РНК обратно транскрибрируется в её комплементарную ДНК (сДНК). Эта ДНК не встроена;

 (c) сДНК переносится в ядро клетки, где она интегрируется в клеточную ДНК в качестве «провируса»;

(d) проявляется провирус.

Однако любая РНК, независимо от того, включена ли она в частицы (вирусные, ретровирусные или микропузырьки) или голая (невоплощенная), может поглощаться клетками и транскрибироваться в обратном порядке.^183-185 И если ретровирусная ДНК включена в клеточную ДНК, то нет причин, по которым то же самое не должно происходить с какой-либо другой ДНК, комплементарной или нет.¹⁰⁰ Другими словами, доказательства, подтверждающие, что поли(А) РНК Галло, «ВИЧ-геном», выполнили три шага: вход, обратную транскрипцию и интеграцию, не доказывают, что поли(А) РНК Галло является ретровирусной.

3. Клонировать сДНК поли(А) РНК

Они получили несколько различных сДНК-клонов, но поскольку любая ДНК, вирусная или невирусная, может быть клонирована, это не добавляет поддержки для утверждения о том, что их поли(А) РНК является ретровирусной.

4. Доказать, что поли(А) РНК представляет собой геном экзогенного вируса

Это было разделено на две части: in vitro и in vivo.

In vitro: Несколько неинфицированных клеточных линий различного происхождения культивировали с супернатантом из «инфицированных» H9-клеточных культур, то есть с тем же супернатантом, из которого была получена их поли(А) РНК (сДНК). Клоны сДНК использовали как ДНК-зонды «инфицированных», а также множества неинфицированных клеток. Положительные результаты были получены только в случае «инфицированных» клеток. Однако, поскольку сДНК-зонды представляют собой обратные транскрипты материала (РНК), происходящего из того же супернатанта, который используется для «заражения» клеток, можно ожидать положительных результатов, даже если и сДНК-зонд, и ДНК, обнаруженные в клетках, являются клеточными. Это ничем не отличается от обнаружения ДНК подозреваемого на месте преступления.

In vivo: Когда те же самые cДНК-зонды использовались для тестирования клеток у больных СПИДом, то есть клеток у людей, которые должны быть инфицированы ВИЧ, не было получено никаких доказательств гибридизации. Другими словами, «ВИЧ-геном» был обнаружен там, где он был экспериментально введен, но не там, где он должен был бы быть, если бы он был экзогенным ретровирусом.

Познавательные статьи:



Психологические особенности спортивного соревнования

Приготовление дезинфицирующих растворов различной концентрации

Занятость населения и рынок труда

Социальный статус семьи и её типология