Монтанье и другие ЭМ «вирус-продуцирующих пуповинных лимфоцитов»

↑

▷ Содержание

⇐ ПредыдущаяСтр 5 из 20Следующая ⇒

Комментарии

В 1971 году нобелевский лауреат Говард Темин (Howard Temin), первооткрыватель обратной транскриптазы, сообщил об изоляции обратной транскриптазы из неинфицированных клеток крысы и заключил, что активность обратной транскриптазы (RT-активность) «Не обязательно представляет онкогенные [ретро] вирусы»³⁷. В 1976 году никто иной, как Галло, показал, что обратная транскриптаза встречается в нормальных, НЕ зараженных вирусом клетках, стимулированных ФГА³⁸. Митогенная стимуляция (ФГА или другими митогенами) обязательна в экспериментах по «изоляции» ВИЧ: феномен, который, как утверждается, говорит об изоляции ВИЧ, не появляется без митогенной стимуляции. Некоторые часто встречающиеся микробы, включая бактерии³⁹ и вирус гепатита B (обычная инфекция для пациентов, болеющих СПИДом, включая их T4-клетки⁴⁰), занимаются обратной транскрипцией. Текущий список их более чем ста, ретро-транскрибирующих (обратно транскрибирующих) вирусов ЗДЕСЬ: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?p=7&id=35268

В фильме «Дом Чисел», нобелевский лауреат Дэвид Балтимор (David Baltimore)  сказал Леунгу, «обратная транскрипция очень широко распространена»⁴¹. В Австралии в 2001 году о неспецифичности обратной транскриптазы была сказано только в статье в рыночном журнале, оценивающей инвестиционный потенциал биотехнологических компаний⁴². До сих пор научная литература о ВИЧ/СПИДе наполнена заявлениями об определении, передаче, изоляции и даже подсчете ВИЧ, основанными только на определении активности обратной транскриптазы^43,44. В 1997 году Яап Хаутшмит (Jaap Goudsmit), один из известнейших ВИЧ-экспертов, утверждал: «лимфоузел BRU был первым культивирован в январе 1983 года, и 15 января из него выделили энзим, уникальный для группы лентивирусов [ретровирусов]»⁴⁵. Несмотря на все свидетельства обратного (большинство из них их собственные из 70-х годов), ведущие ВИЧ-эксперты до сих пор утверждают, что обратная транскриптаза специфична для ретровирусов.

На самом деле, во время интервью с французским журналистом-документалистом Джамелом Тахи (Djamel Tahi,), коллега Монтанье Жан-Клод Шерман сказал: «Второе дело относится к определению активности обратной транскриптазы, специфичного для ретровирусов энзима» (Д. Тахи, во время личного общения). В 2006 году эксперт по ВИЧ Дэвид Хо (David Ho ) сказал в интервью PBS: «Обратная транскриптаза это энзим ретровирусов… один способ взглянуть на ретровирусы - это просто измерить возможность обратной транскрипции, и, на самом деле, это как Барре-Синусси и её коллеги открыли ВИЧ… Они показали эту RT-активность как передающуюся в клеточной культуре»⁴⁶.

Для Монтанье определение активности обратной транскриптазы значило ВИЧ-инфекцию BRU. То же самое заключение утверждалось всеми другими исследователями ВИЧ, включая Галло и его коллег в 1984, выполнявших похожие эксперименты на своих пациентах. На самом деле, интерпретация активности обратной транскриптазы в качестве ретровируса противоречит научным данным. Во время интервью Тахи в июле 1997 в институте Пастера Монтанье правильно сослался на «RT-активность, энзима, характеризующего ретровирусы»⁴⁷. Он не сказал специфичной «для ретровирусов».

Все эксперименты Монтанье выполнялись, используя либо некачественный контроль, либо без контроля. Контроль является важной частью научно обоснованного эксперимента, разработанный, чтобы показать, что фактор, который проверяется, на самом деле ответственен за наблюдаемый эффект. В контрольном эксперименте все факторы, кроме того, который проверяется, точно такие же как и в тестовых экспериментах, и выполняются точно такие же измерения. Использование контроля элементарно и, в случае ретровирусов, решающе. В экспериментах Монтанье контролем было то, что доказывало бы, что феномен, интерпретированный как «ретровирусный», такой, как RT-активность, это не результат непредусмотренных, искажающих неретровирусных факторов или экспресии эндогенных ретровирусов⁴⁸, которые присутствуют во всех нас^49,50. («Эндогенный ретровирус» означает присутствие последовательности сходных с ретровирусами геномов в человеческой ДНК, которые не превращаются в инфекционные частицы (следовательно термин неправильный). 8% человеческой ДНК состоит из таких последовательностей^49,50. «Производство эндогенного ретровируса в клеточной структуре может начаться спонтанно или может быть вызвано химическими реактивами или радиацией)⁵¹.

Никогда невозможно учесть каждый искажающий фактор в эксперименте, но как минимум способ контроля должен учитывать каждый известный фактор. Это включает в себя in vivo физиологическое состояние пациентов, от которых были получены предположительно инфицированные клетки и сыворотка, и in vitro условия, под которыми клетки культивировались, обрабатывались и содержались. Много научных публикаций говорят, что клетки, не заражённые ретровирусом, культивированные под теми же условиями, что и «заражённые клетки», производят один или более феноменов, про которые говорят, что они доказывают ретровирусную «изоляцию» «инфицированных» клеток. В 1976 году ретровирусолог Джордж Тодаро заявлял, что неудача в производстве похожих на ретровирус частиц в клеточных культурах «может отражать ограничения техник ко-культивации in vitro»⁵², таким образом, ограничения условий преобладали в частности в клеточных культурах в то время, когда проводился эксперимент. Перед эрой СПИДа Галло, Вайс и другие ученые опубликовали статьи, показывающие, что «экспрессия эндогенных ретровирусов может затрагивать результаты экспериментов по другим темам»^38,53.

Контроли, применяемые в исследовании ВИЧ должны быть клетками и сыворотками, полученными от похожих на пациентов со СПИДом, но у которых нет СПИДа и кто не принадлежит к группе риска по СПИДу. Похожесть должна включать в себя клинические, гематологические, биохимические, серологические (гипергаммаглобулинемия) и метаболические (клеточная оксидация) результаты, которые хорошо документированы у пациентов со СПИДом. Контрольные эксперименты должны выполняться параллельно с тестовыми экспериментами, причем как тестовые, так и контрольные эксперименты должны трактоваться одинаковым способом. Чтобы минимизировать предвзятость, экспериментатор не должен был знать, какая группа тестовая, а какая контрольная. Ни в одном из своих экспериментов Монтанье о таких данных не сообщал. Невыполнение твёрдых правил контроля и вообще любого контроля переполняет исследования ВИЧ. Первый «контроль» Монтанье состоял из культуры лимфоцитов от здорового человека, в которой RT-активность не определялась. Этот «контроль» был неправильным, потому что вне зависимости от воздействия предполагаемого вируса, эти клетки были в состоянии, не сравнимом с таковым у пациента со СПИДом.

Монтанье не доказал, что RT-активность была из-за ретровирусного энзима. Более того, он не доказал, что энзим обратно транскрибировал ретровирусную РНК или даже клеточную РНК. Он определил RT-активность, внедрив искусственную РНК в культуру, РНК, к которой был прицеплен короткий сегмент искусственной ДНК. Эта РНК-ДНК известна как матричный праймер (затравка) и состоит из 100-200 повторов одной и той же рибонуклеидной последовательности (матрица), заглушенной с одного конца одной последовательностью ДНК. Искусственный матричный праймер, повсеместно использованный Монтанье, это An.dT_12,15 [также известный как (aka((rA)n.(dT)_12,15) и An.dT₁₅. Этот матричный праймер транскрибируется не только обратной транскриптазой, но и клеточной ДНК-полимеразой. Монтанье знал, что в 1980 году имелось доказательство того, что «среди ряда матричных праймеров (rA)n.(dT)_12,18 наиболее часто использовался, поскольку обратная транскриптаза показывает высокую активность с этим матричным праймером. Однако  клеточные ДНК полимеразы (полимераза β и полимераза γ) также эффективно используют этот же самый матричный праймер»⁵⁴. Фактически,  в 1975 году одна из этих полимераз, ДНК-полимераза γ, была определена как клеточный энзим, который «копирует An.dT₁₅ с высокой эффективностью, но не очень хорошо копирует ДНК»⁵⁵. Последнее подтверждается в обзоре ДНК-полимеразы γ, опубликованным Лори Кагуни (Laurie Kaguni)  из отдела биохимии и молекулярной биологии Мичиганского государственного университета в 2004 году⁵⁶. Более детальный обзор обратной транскрипции и обратных транскриптаз

ЗДЕСЬ :http://theperthgroup.com/HIV/ReverseTranscriptasesFinal.pdf

Второй эксперимент Монтанье

Метод: Т-клетки BRU были ко-культивированы с Т-клетками здорового донора крови.

Результат: Определение активности обратной транскриптазы. Данные электронной микроскопии не опубликованы.

Интерпретация Монтанье: «Размножение» (передача) и «изоляция» ретровируса

Комментарий

Доказательство передачи требует введения очищенных, похожих на ретровирус частиц в неинфицированную клеточную культуру, за которыми следует появление частиц, морфологически и биохимически идентичных введённым и с отрицательным результатом в контрольной группе. Несмотря на то, что указывалось: «Образцы [надосадочной культуры] регулярно брались для… проверки на электронном микроскопе», Монтанье не опубликовал свидетельств присутствия похожих на вирус частиц в его ко-культуре. У Монтанье не было контроля. Второй контроль должен был состоять из лимфоцитов здорового донора, ко-культивированных с Т-лимфоцитами больного человека, как описано выше. Если даже RT-активность специфична для ретровируса, определение этой активности не может расцениваться как доказательство передачи. RT-активность может быть связана с клетками BRU, как это было в первом эксперименте. Доказательство передачи требует доказательства того, что RT-активность была вызвана Т-клетками здорового донора крови. В этом эксперименте не было такого свидетельства. И опять, даже если фермент специфичен для ретровируса, RT-активность это не изоляция ретровируса. Определение сердечных или печеночных ферментов в крови пациента не значит, что в лаборатории изолировали сердце или печень пациента.

Третий эксперимент Монтанье

Это иллюстрирует вторую крупную ошибку в построении “вируса СПИДа”, на этот раз с участием предполагаемых вирусных частиц. После провала выявить частицы в культуре из первых двух экспериментов супернатант (надосадочная жидкость), полученный из второго эксперимента, инкубировали лимфоцитами, полученными из пуповинной крови двух плацент.

Meтод: Супернатант от BRU + здоровые доноры крови Т-клеточной ко-культуры были добавлены к пуповинным Т-клеточным культурам.

Результат: Одна электронная микрофотография культуры, показывающая ретровирус-подобные частицы.

Интерпретация Монтанье: BRU инфицирован «типичным С-типом» ретровирусом.

Комментарий

Одна электронная микрофотография Монтанье из культуры лимфоцитов пуповины является единственным электронно-микроскопическим доказательством того, что клетки BRU были заражены ретровирусом⁵⁷, но это утверждение окружено многочисленными неопределенностями.

В 2010 году Барре-Синусси описала события, приведшие к микрофотографии:^32,41

...и затем [после нахождения RT-активности в культуре клеток] ...мы немедленно позвонили нашему парню, который отвечал за электронную микроскопию и сказали, пожалуйста, не могли бы вы посмотреть под микроскопом, можете ли вы увидеть частицу вируса, и если она похожа на ретровирус...а после, после, совсем, было очень сложно, потому что это было только несколько инфицированных клеток, так что это была очень сложная задача, для него, чтобы найти клетки, которые просто продуцировали эти частицы, но, наконец он нашел это, и он нашел один лимфоцит, с многообещающей частицей типичного ретровируса, и, очень близко от этой клетки одна полная зрелая частица, похожая на ретровирус. (В 2005 году электронный микроскопист Шарль Доге (Charles Dauguet) и соавтор Монтанье рассказал Джамелю Тахи, что его попросили изучить культуру клеток только после 15 дней неудачного поиска частиц в градиенте плотности «очищенного вирусного» материала⁵⁸).

Монтанье не имел контроля. Контроль для третьего эксперимента, третий контроль, должен состоять из добавления супернатанта от второго контрольного эксперимента (как определено выше) в пуповинную культуру лимфоцитов. Культура, также как и градиент плотности очищенных супернатантов от теста и контроля должны были быть представлены для электронной микроскопии Доге, который должен был потратить то же время и усилия, изучая оба набора образцов. Что контроля не было подтвердил Доге, когда он его спросили, смотрел ли он контрольные образцы: «Нет...я так не думаю. Образцы, с которыми я работал, были из заражённых культур».⁵⁸

Согласно определению, ретровирусы являются «оболочечными вирусами с диаметром 100-120 нм с шипами на клеточных мембранах. Выпущенные клетками вирионы [частицы, свободные от клеток] содержат конденсированные внутренние тела (ядра) и усваиваются проекциями (шипами, ручками)».⁵⁹ Согласно их способу сборки и тонкой структуры, они делятся на подсемейства и роды. На сегодняшний день ни Монтанье, ни Галло не опубликовали электронной  микрографии  частиц, подтвердивших, что они «ВИЧ» и демонстрирующих все морфологические характеристики ретровирусных частиц.

В 1984 году частицы Монтанье были зарегистрированы как «типичные частицы ретровируса типа С», принадлежащего к роду Oncovirinae, подсемейству Retroviridae⁶⁰. Годом позже, Галло также сообщил о своем ВИЧ как частице типа С. Тогда же в 1984 году эксперты по ВИЧ (включая Монтанье) сообщили о том, что ВИЧ является членом другого рода Oncovirinae, т. е. ретровирусных частиц типа D.^{61, 62} В 2003 году, используя атомную силовую электронную микроскопию (с разрешением в доли нанометра), Юрий Кузнецов и его коллеги показали, что частицы ВИЧ «практически неотличимы от вирионов [вирусных частиц] вируса MuLV” (вирус мышиной лейкемии)⁶³. MuLV является прототипом ретровирусной частицы типа С.⁶⁴ Затем в 1986 году, когда имена LAV и HTLV-III были сброшены, частицы типа С Монтанье и Галло были переименованы в ВИЧ и классифицированы как род лентивируса, принадлежащий к другому Подсемейству Retroviridae, то есть, Lentivirinae.¹⁷ (Частицы, которые Монтанье предъявил как ВИЧ в своей Нобелевской лекции⁶⁵ в декабре 2008 года, бросают вызов классификации ^{66, 67}

ЗДЕСЬ http://www.theperthgroup.com/Nobel/MontagnierEMNobel.pdf

Ретровирусная таксономия, используемая до и в течение 1980-х годов, описана в Перспективах  медицинской вирусологии», том 3, 1987 (Perspectives in Medical Virology Volume 3 dated 1987), «Критерии классификации ретровирусов являются главным образом морфологическими признаками,  как видно на ультратонких срезах: местоположение  ядра (таблетированное в цитоплазме или образованное во время бутонизации процесса в плазматической мембране); форма и размер поверхностных выступов (подобные шипу или ручке); наличие или отсутствие электрон-светящегося пространства между оболочкой и ядром в незрелых частицах, а также форма и расположение ядер в зрелых частицах».⁶⁰ Учитывая эти факты, крайне маловероятно, что электронные микроскописты могли  бы ошибочно классифицировать один и тот же вирус членом двух Подсемейств и трех родов семейства Retroviridae. Или нет согласия, к какому Подсемейству или роду принадлежит «ВИЧ», или, поскольку вирусы Монтанье и Галло являются «типичными типа С»  частицами и вирусы-типа С  не являются лентивирусами, ретровирус, называемый сейчас ВИЧ, не мог быть обнаружен, о чём сообщали Монтанье и Галло в 1983 и 1984 годах соответственно.

Модель Ганса Гельдерблома (Hans Gelderblom) «идеальной» ВИЧ-частицы.^{59, 68}

ВИЧ-эксперты согласны с тем, что на поверхности вирусной частицы имеются шипы/вздутия, присутствие которых является абсолютным требованием для инфицирования.⁶⁹  Говорят, что вздутия состоят из двух белков: gp120 и gp41 (GP = гликопротеин). Ганс Гельдерблом из Института Роберта Коха в Берлине является ведущим экспертом в области электронной микроскопии ВИЧ. В 1987 году он и его коллеги опубликовали модель «идеальной» частицы ВИЧ, утверждая, что «На «идеальной» нетронутой частице ВИЧ можно определить 72 вздутия». Тем не менее, в своих самых подробных электронных микроскопических исследованиях группа Гельдерблома сообщила, что «высвобождаемые клетками, «зрелые» частицы ВИЧ представляют собой на сегодняшний день большинство вирусных структур...Потеря ручек с поверхности, очевидно, коррелирует морфологически с созреванием вируса. Незрелые и/или начинающие частицы ВИЧ “покрыты шипами”, но они редко наблюдаются» и наблюдаются только “на клетках с нарушениями обмена веществ”.^{59, 68, 70} незрелые частицы имеют вздутия, но по определению не заразны. Поскольку вздутия имеют решающее значение для инфекционной активности, но теряются во время созревания, зрелые частицы также не могут быть инфекционными.

В 2006 году Пин Чжу и коллеги ⁷¹ опубликовали в Nature статью на тему «Распределение и трехмерная структура шипов в оболочке вируса СПИДа». Несмотря на название, предполагался дискурс об “оболочечных шипах” ВИЧ, на самом деле они проанализировали и "создали трехмерную (3D) модель SIV (СИВ) [вирус иммунодефицита обезьяны] [оболочка] шип, но не ВИЧ. Кроме того, они утверждали, что частицы ВИЧ имеют " 14 ± 7 оболочечных шипов на частицу (диапазон от 4 до 35) (см. примеры на рис. 2b-d)”. Однако фиг. 2b-d показывает только «поверхностно-визуализационные модели»  вирионов ВИЧ с «предполагаемыми оболочечными шипами» (выделено мной). На снимках на рис. 1b (ВИЧ-1 ниже), которые предположительно являются их лучшими «примерами предполагаемых  оболочечных шипов на выбранных вирионах», трудно, если не невозможно, увидеть какие-либо шипы на частицах ВИЧ-1 (выделено мной). Изображение ВИЧ-1 также содержит структуры, напоминающие «предполагаемые оболочечные шипы» в частях изображения, где нет частиц. Эти мнения разделяют бескорыстные ученые, компетентные в этой области⁷².

Надпись Чжу гласит: «Рис. 1. Представлены томографические изображения мутанта SIV и дикого типа ВИЧ-1....Примеры предполагаемых оболочечных шипов на выбранных вирионах обозначены стрелками...

Масштабные полосы, 100 нм» (сверху справа на каждом изображении).

Это согласуется с предыдущей работой исследователей, где «Иммуноэлектронный микроскопический анализ с использованием сывороток от ВИЧ-1-инфицированных пациентов» показал небольшую маркировку [антителами, которые связываются с белками ручек/шипов] зрелых частиц ВИЧ-1» ⁷³ и с выводами Ганса Гельдерблома. Различия между Гельдербломом и Чжу с другими: (i) Гельдерблом утверждает, что шипы быстро теряются в процессе созревания, тогда как, по мнению Чжу и коллег, шипы не теряются, но их количество определяется, прежде всего, низким включением поверхностных ВИЧ-белков в частицы; (ii) по мнению Гельдерблома, «возможно, что структуры, напоминающие вздутия, могут наблюдаться даже тогда, когда не было gp120 [шипов], то есть ложных срабатываний» ⁷⁴, тогда как Чжу и др. называют их «предполагаемыми оболочечными шипами». В комментариях на последнее предложение Чжу и др. в Nature ⁷⁵ Деннис Бартон (Dennis Burton) ссылался на статью Кузнецова и др в Журнале вирусологии 2003 года, в которой отмечалось, что «исследования  с помощью атомной силовой микроскопии дали другое представление об оболочечном шипе ВИЧ». В своей работе Кузнецов и др⁶³. объясняют, что они выбрали атомно-силовую микроскопию для своего анализа, потому что «криоэлектронная микроскопия, по-прежнему страдает от проблем в интерпретации результатов из-за суперпозиции признаков».

Их данные показали, что «Группы gp120 не образуют шипов на поверхности ВИЧ, как это обычно описывается в литературе», и они «не обнаружили никаких доказательств того, что мономеры gp120 образуют тройные симметричные тримеры ... Мы предполагаем, что шипы, наблюдаемые с помощью электронной микроскопии с отрицательной окраской, могут быть артефактом проникновения пятна тяжелого металла между белками оболочки. Действительно, термин «шип», по-видимому, принял довольно неточное, возможно вводящее в заблуждение определение, и его можно было бы использовать с осторожностью». Другими словами, «различный взгляд на оболочечный шип ВИЧ» Бартон приписывает Кузнецову, что у ВИЧ нет оболочечных шипов.

Таксономия и отсутствие шипов/ручек - не только проблемы «частичек ВИЧ». Некоторые из них включают:

1. Ретровирусные частицы типа С являются вездесущими. Они присутствуют «в большинстве, если не во всех, плацентах человека» ⁷⁶, а также в тканях из рыбы, змей, фазанов, перепелов, куропаток, индейки, мышей, агути, ленточных червей, насекомых и млекопитающих.⁷⁷ Электронная микрофотография частиц «ВИЧ» Монтанье была таковой в культуре лимфоцитов, полученных из пуповинной крови двух плацент человека.

2. В третьем эксперименте Монтанье к лимфоцитам пуповинной крови добавляли бесклеточный супернатант из культуры клеток BRU. Следовательно, частицы должны были возникнуть из этих клеток.

Тем не менее, лимфоциты пуповинной крови вызывают ускоренную бутонизацию вирусоподобных  частиц «независимо от ВИЧ-инфекции».^78-80 Поскольку у Монтанье не было никаких контролей, невозможно связать частицы типа С, наблюдаемые в третьем эксперименте, с передачей ретровируса, происходящего от BRU.

3. Клетки от СПИД-пациентов часто культивируются совместно с бессмертными клеточными линиями, такими как H9, которые, как утверждается, облегчает то, что Галло называет «непрерывным производством» и «истинной изоляцией» ВИЧ⁸¹. Однако электронная микроскопия показывает множество ретровирусных и неретровирусных частиц в этих культурах. ^{59, 82, 83, 84} ВИЧ-эксперты продолжают  молчать о происхождении, характере, роли и взаимосвязи этих частиц со СПИДом.⁸⁵

4. Частицы, идентифицированные как ВИЧ, наблюдаются в увеличенных лимфатических узлах больных СПИДом. Однако идентичные частицы наблюдаются также с одинаковой частотой в увеличенных лимфатических узлах пациентов, не имеющих СПИДа и не подверженных риску СПИДа. О таких пациентах сообщалось, в обширном, подробном и ослепительном электронно-микроскопическом исследовании О'Хары (O'Hara) и его коллег из Гарварда. "Частицы ВИЧ" были обнаружены у 18/20 (90%) пациентов с увеличенными лимфатическими узлами, отнесенными к СПИДу, тогда как идентичные частицы были обнаружены у 13/15 (87%) пациентов с увеличенными лимфатическими узлами, не отнесенными к СПИДу.⁸⁶

Познавательные статьи:



Техника нижней прямой подачи мяча

Комплекс физических упражнений для развития мышц плечевого пояса

Стандарт Порядок надевания противочумного костюма

Общеразвивающие упражнения без предметов