Получение и культивирование суспензии клеток. Культура изолированных протопластов высших растений.

↑

⇐ ПредыдущаяСтр 10 из 12Следующая ⇒

Суспензионные культуры получают из рыхлой каллусной ткани, помещая ее в жидкую питательную среду того же состава, что и для каллуса, и выращивают в колбах на качалке (100-120 оборотов в минуту). Рекомендуется использовать жизнеспособную, интенсивно пролиферирующую каллусную культуру, которая легко распадаться на небольшие клеточные агрегаты и отдельные клетки.

Максимальный объем инокулята (критическая концентрация клеток в суспензии), обеспечивающий клеточное размножение в суспензии, обычно составляет 10-20 % от общего объема суспензии в начале культивирования. Повышенные количества инокулята приводят к угнетению роста клеточной популяции вследствие недостатка кислорода и накопления в среде токсических продуктов метаболизма.

Длительность первого цикла выращивания суспензии обычно равна 15-20 дней в зависимости от вида растения, из которого она была получена, состава среды, скорости вращения качалки. В течение этого времени часть клеток отмирает, происходит дезагрегация каллуса и интенсивное деление живых клеток. Последующие циклы сокращаются до 2 недель. Суспензию надо пересаживать после появления на стенках колбы ободка из живых клеток [8 c.22-23].

Изолированный протопласт – это вся клетка, за исключением целлюлозной клетки. Несомнемным преимуществом изолированных протопластов является удобство использования их в качестве модели для улучшения транспорта различных веществ через внешнюю клеточную мембрану.

Изолированные протопласты представляют несомненный интерес для улучшения электрических свойств мембраны и воздействий на неё химических и физических факторов [9 c.101-118].

В настоящее время применяют энзиматический способ выделения протопластов. Его сущность заключается в том, что для удаления клеточных стенок используют ферментные препараты. Этот способ имеет ряд преимуществ перед предыдущим: 1) возможность выделения больших количеств протопластов; 2) отсутствие сильного осмотического сжатия ИП; 3) сохранение интактности ИП; 4) быстрота.

В энзиматическом способе выделения протопластов используют препараты трех типов целлюлазы, гемицеллюлазы и пектиназы. Обработка растительных клеток чаще проводится комбинацией ферментов; соотношение их варьирует в зависимости от вида растения, типа ткани, функциональных особенностей, возраста, наличия вторичной клеточной стенки и т. д.

Приведем примеры используемых ферментов и осмотиков при выделении протопластов из разных объектов:

Ø из плодов пасленовых пектиназа;

Ø  из мезофилла листа табака: целлюлоза 2,5%; пектиназа 0,25%,

Ø маннит 0,4 М;

Ø из мезофилла листьев и суспензионных культур картофеля: ксиланаза 2 %, маннит 0,3 0,4 М;

Ø из каллусных тканей пшеницы: целлюлаза 1000 2%, пектатлиаза

0,3 %, СаСl2 0,25 М;

Ø из гипокотилей рапса: целлюлаза 0,5%, мацерозим 0,05%, маннит

0,4 М [10 c.45-50].

Познавательные статьи:



Техника прыжка в длину с разбега

Организация работы процедурного кабинета

Области применения синхронных машин

Оптимизация по Винеру и Калману