Импрегнирование сцинтиллятора в гель

↑

▷ Содержание

⇐ ПредыдущаяСтр 13 из 14Следующая ⇒

Возможен и обратный подход к решению проблемы счета ра-
диоактивности белка после электрофореза — вместо элюции бел-
ка можно попытаться импрегнировать сцинтиллятор в кусочек
геля, заменив им водное окружение радиоактивного белка и со-
хранив при этом прозрачность геля. Такая попытка реальна.
В одном из описанных вариантов ПААГ дегидратируют в абсо-
лютном этаноле, потом этанол заменяют на толуол, а его—на
толуол-тритоновый сцинтиллятор [Gezelins, 1977]. По-видимому,
лучше начинать с замены воды в геле на диметилсульфоксид.

При этом гель не будет съеживаться и терять прозрачностикак
это происходит при вымачивании его в этаноле.

Во всех случаях, когда обработке геля предшествует его раз-
резание, следует стремиться к тому, чтобы в одном кусочке геля
была вырезана целая полоса или все белковое пятно. Широко
распространенная практика разрезания цилиндрика геля на оди-
наковые диски толщиной 1—1,5 мм неудачна, так как разрез
«вслепую» может попасть на середину полосы. В результате это-
го радиоактивность, содержащаяся в полосе, будет просчитана в
двойном объеме геля, что даст ложную картину вдвое более ши-
рокого и низкого пика радиоактивности на электрофореграмме.

Разумеется, для того чтобы правильно вырезать белковую
полосу, ее надо окрасить, а это трудно сделать при малой кон-
центрации белка в полосе, что нередко имеет место при фрак-
ционировании радиоактивно меченных белков. Однако разработ-
ка новых высокочувствительных методов окрашивания белков,
например серебром, поможет решить эту проблему.

Авторадиография

Регистрацию полос радиоактивных белков в пластине геля
можно осуществить методом авторадиографии. На гель наклады-
вают рентгеновскую пленку и экспонируют ее в течение длитель-
ного времени в темноте, обычно при комнатной температуре.
Экспозицию ведут в кассете, где пленка прижимается к гелю
пружинами через резиновую прокладку. В зависимости от уров-
ня радиоактивности белков экспозиция может длиться от не-
скольких часов до многих дней. Затем пленку проявляют обыч-
ными проявителями, предназначенными для получения макси-
мально контрастного изображения. Под действием b-излучения
участки пленки, лежавшие над белковыми полосами и пятнами,
чернеют. Авторадиографию имеет смысл проводить только в тех
случаях, когда белки мечены радиоактивным углеродом или
йодом. Энергия излучения трития слишком мала, чтобы испус-
каемые им b-частицы смогли преодолеть воздушный промежуток
между гелем и пленкой, да и просто вылететь из пластины, ввиду
их сильного поглощения в геле.

Потеря энергии b-частиц в геле достаточно велика и в слу-
чае использования радиоактивного углерода, поэтому перед
авторадиографией гель высушивают. Кстати, толщина высушен-
ного геля будет тем меньше, чем меньше содержание в нем ме-
тиленбисакриламида. Для высушивания гель переносят на
фильтровальную бумагу («Whatman 3MM»), под нее подклады-
вают пористую прокладку и перфорированную металлическую
пластинку. Все это помещают в полиэтиленовый мешок и при-
соединяют к вакуумному насосу. При подогревании в горячей
воде или под лампой гель высыхает за 1—2 ч, образуя тонкую
прочную пленку на поверхности фильтровальной бумаги. Есть
множество фирменных устройств для сушки гелей. В них пласти-

ну геля обычно кладут на подключенную к вакуум-насосу по-
ристую основу и накрывают листом тонкой резины, которую при-
сасывает вакуумом. Во избежание прилипания резины к гелю
под нее можно положить тонкую пленку. Несмотря на высуши-
вание, регистрация р-частиц углерода из глубинных слоев не-
возможна для гелей с исходной толщиной более 0,4 мм.

Для авторадиографии следует использовать неэкранирован-
ную рентгеновскую пленку типа «Kodak No Screen X-Ray Film»,
например: NS-5T (США) или РТ-1 и РТ-2 (СССР). Фирма
LKB (Швеция) рекламирует пленку, пригодную для авторадио-
графии препаратов, меченных тритием, под названием «LKB-
Ultrafilm». Суть дела здесь не в повышении чувствительности,
а в отсутствии защитного слоя над фотографической эмульсией.
Это облегчает проникновение в нее «слабых» b-электронов три-
тия, но затрудняет последующую обработку пленки. Чувстви-
тельность метода авторадиографии для регистрации ¹⁴С можно
оценить из следующих ориентировочных данных. Радиоактив-
ность порядка 25000 распадов в минуту, равномерно распреде-
ленная по площади 1 см², надежно регистрируется за 24 ч экспо-
зиции.

Для регистрации g-излучения ¹²⁵I удобно применять способ
«непрямой» авторадиографии. g-Излучение регистрируется рент-
геновской пленкой, но большая его часть пронизывает ее и те-
ряется, поэтому позади пленки устанавливают так называемый
«интенсифицирующий экран», покрытый твердым сцинтиллято-
ром (CaVO₄). Под действием g-излучения экран флюоресцирует,
а свет этой флюоресценции регистрируется пленкой. Разрешение
и резкость полос при этом несколько ухудшаются, поскольку
экран удален от геля на толщину пленки, а не все g-частицы вы-
летают из геля перпендикулярно его поверхности, зато выигрыш
в чувствительности получается значительный.

Для непрямой авторадиографии следует использовать экра-
нированные рентгеновские пленки, например: «Kodak X-Omat R»
и «Kodak RP-50» (США) или РМ-1 (СССР). Интенсифицирую-
щие экраны выпускают, в частности, фирма «Du Font» (США)
под названием «Lightning Plus Intensifying Screen» и химфарм-
завод им. Семашко под маркой ЭУ-ВЗ.

Для повышения чувствительности пленки ее иногда предва-
рительно засвечивают до плотности потемнения (после проявле-
ния), соответствующей A ₅₄₀=0,2—0,3. Объяснение этого стран-
ного на первый взгляд феномена можно найти в работе [Laskey,
Mills, 1975].

Флюорография

Для регистрации положения в геле белков, меченных три-
тием, применяют метод флюорографии. Смысл его в том, чтобы
ввести сцинтиллятор внутрь геля таким образом, чтобы он нахо-
дился в непосредственном контакте с радиоактивными белками
в полосах. Свечение сцинтиллятора внутри геля легко выходит

из него наружу и регистрируется наложенной на гель рентгенов-
ской пленкой того же типа, который используют при непрямой
авторадиографии. По существу говоря, такой подход уже был
рассмотрен выше, но тогда не стояла задача сохранения геомет-
рических размеров целой пластины геля, чего трудно добиться
при импрегнировании в гель жидкого сцинтиллятора.

Повсеместное распространение для флюорографии гелей по-
лучила процедура, предложенная в 1974 г. Боннером и Ласки.
Сначала воду в геле замещают на диметилсульфоксид (ДМСО),
вымачивая пластину после фиксации в ней белков в течение 1 ч
в двух сменах по 20 объемов ДМСО (по отношению к объему
геля). Надо помнить, что ДМСО ядовит и легко проникает через
кожу, поэтому работать следует в перчатках. Затем гель перено-
сят на 3 ч в 4 объема 22%-ного (масса/объем) раствора ППО в
ДМСО; за это время ППО входит в гель. ДМСО не является
сцинтилляционным растворителем, поэтому его необходимо
убрать, но так, чтобы ППО остался в геле. Высушить ДМСО не
удается, и приходится прибегать к следующему приему. Гель
переносят в воду и вымачивают в ней около 1 ч. ППО в воде не-
растворим и немедленно выпадает в осадок. Гель становится
белым, непрозрачным и заметно твердеет, зато ДМСО снова за-
мещается на воду, которую затем нетрудно высушить, как было
описано выше. На фильтровальной бумаге после высушивания
остается жесткая белая пленка. Хотя она на вид и непрозрачна,
но вспышки сцинтилляций внутри нее (в местах контакта ППО
с радиоактивными белками) дают достаточно света, чтобы быть
зарегистрированными рентгеновской пленкой. В результате до-
статочно продолжительного экспонирования на пленке появляет-
ся картина расположения радиоактивных полос или пятен в геле
[Bonner, Laskey, 1974]. Засвечивание пленки для повышения ее
чувствительности производят и в этом случае. Экспонирование
пленки следует вести при температуре сухого льда, поскольку
при более высокой, пусть даже и отрицательной температуре
резко снижается чувствительность метода.

Гели с низким содержанием акриламида, например смешан-
ные гели из 2%-ного ПААГ и агарозы, могут растворяться в
ДМСО. Для них в аналогичной процедуре следует заменить
ДМСО на метанол (10%-ный раствор ППО в метаноле). Для
более концентрированных гелей метанол непригоден — гели в
нем сжимаются.

Концентрированные и сильно сшитые гели часто трескаются
при сушке обычным способом. Вакуум к гелю обычно подается
только с одной стороны через сетку и фильтровальную бумагу.
К противоположной стороне геля во время сушки плотно приле-
гает полиэтиленовая пленка или тонкая резина. Это приводит к
тому, что со стороны бумаги гель затвердевает раньше («стек-
ленеет»), а на противоположной его поверхности остается влага,
которая может быть отсосана только через трещинки в геле. Во
избежание этого дефекта было предложено между свободной по-

верхностью геля и пленкой или резиной прокладывать слой по-
ристого полиэтилена, через который вакуум подается и к этой
поверхности геля [Joshi, Haenni, 1980].

Недавно было указано на возможность замены ППО в каче-
стве сцинтиллятора на салицилат натрия [Chamberlain, 1979].
Для него максимум флюоресценции лежит вблизи 410 нм, что
вполне приемлемо для экранированной рентгеновской пленки.
Главное же преимущество этого реагента — в его водораствори-
мости. Автор работы предлагает просто вымачивать гель в
10 объемах 1 М водного раствора салицилата натрия в течение
30 мин при комнатной температуре, а затем сушить и флюоро-
графировать, как обычно. Нагревать гель во время высушивания
следует не выше, чем до 80°, во избежание возгонки салициловой
кислоты. Раствор салицилата можно хранить в течение 1—2 не-
дель. Потом он коричневеет (по-видимому, окисляется).

После флюорографии для количественных определений ра-
диоактивности полосы из высушенного геля можно вырезать,
дать им снова набухнуть в минимальном количестве воды и да-
лее растворять с помощью солюбилизаторов. При оценке эффек-
гивности счета в жидком сцинтилляторе можно пользоваться
только методом внутренней стандартизации.

Для правильного совмещения изображения на рентгеновской
пленке с гелем, без чего из него нельзя вырезать нужные для
счета участки, как и при авторадиографии, пользуются реперны-
ми отметками по углам пластины геля. Эти отметки делают ра-
диоактивными чернилами. С этой целью можно использовать
любые не диффундирующие в геле чернила с примесью плохо
растворимого, достаточно активного меченого препарата. Впро-
чем, забота об отсутствии диффузии чернил относится к случаю
авторадиографии влажных гелей, например при регистрации ра-
диоактивного фосфора. Для высушенных гелей это не так суще-
ственно.

Комбинацией авторадиографии и флюорографии можно ре-
гистрировать в геле двойную метку ³Н и ¹⁴С (например, сопо-
ставлять составы двух белковых смесей). В белки одной смеси
вводят радиоактивную метку по ³Н, в белки второй — по ¹⁴С. Обе
смеси объединяют и разделяют двумерным электрофорезом.
Пластину геля импрегнируют сцинтиллятором, высушивают и
регистрируют флюорографией на пленку «Kodak IR-5» сцинтил-
ляцию от обеих белковых смесей (³H+¹⁴С). С негатива делают
контактный отпечаток, так что все пятна радиоактивности ока-
зываются белыми. Затем с того же геля на неэкранированную
пленку «Kodak NS-5T» при комнатной температуре регистрируют
авторадиографией только ¹⁴С. К свету сцинтилляций эта пленка
нечувствительна. Накладывают вторую пленку на позитив с
первой. Не закрытые черным белые пятна указывают местона-
хождение белков, меченных только тритием, т. е. входящих в
состав только одной из двух смесей. Затем изотопные метки двух
белковых смесей можно поменять местами [McConkey, 1979].

Авторадиографией и флюорографией можно пользоваться не
только для пластин, но и для цилиндрических гелей. Для этой
цели из цилиндрика геля надо в продольном направлении выре-
зать плоский слой толщиной 0,5—1,5 мм. Описано простое приспо-
собление, облегчающее эту операцию [Watts et al., 1977].

Флюорографию нитроцеллюлозных фильтров с перенесенны-
ми на их «репликами» белков из геля осуществляют очень про-
сто. Фильтр погружают в 10%-ный раствор ППО в эфире, высу-
шивают и регистрируют сцинтилляцию на рентгеновскую плен-
ку, как это было описано для высушенного геля. Флюорография
и авторадиография нитроцеллюлозных фильтров осуществляется
лучше, чем в случае гелей, так как белки концентрируются на
поверхности фильтров.

Познавательные статьи:



Коммуникативные барьеры и пути их преодоления

Рынок недвижимости. Сущность недвижимости

Решение задач с использованием генеалогического метода

История происхождения и развития детской игры