Напряженность электрического поля (Н)

↑

▷ Содержание

⇐ ПредыдущаяСтр 4 из 14Следующая ⇒

Разность потенциалов, или напряжение, приходящееся на
весь гель, обозначим через Е; тогда для однородного участка
геля длиной l Е = Нl. В проводящей ток жидкости приложен-
ному напряжению Е всегда отвечает некоторая сила тока I, ко-
торая в соответствии с законом Ома определяется суммарным

сопротивлением цепи R (I=E/R). В ПААГ проводящей жидко-
стью служит буфер, находящийся между нитями полимера.
Свой вклад в проводимость вносят и мигрирующие в геле заря-
женные макромолекулы, но ввиду их низкой концентрации этим
вкладом можно пренебрегать.

Электрическое сопротивление буфера определяется двумя
факторами: концентрацией в нем свободных ионов и их электро-
форетической подвижностью. Второй фактор играет очень важ-
ную роль. Например, при одинаковых концентрациях в двух бу-
ферах ионов С1^– и СН₃СОО^– электропроводность первого буфе-
ра будет заметно выше, чем второго. Следует также помнить о
том, что электрический ток одинаков по всей длине электриче-
ской цепи, т. е. в любом сечении трубки или пластины. Разры-
вов или скачков тока по длине геля физически быть не может,
это аксиома. Иначе обстоит дело с напряжением или напряжен-
ностью электрического поля.

Если в любой электрической цепи последовательно включе-
ны два различных по своей величине сопротивления R ₁ и R ₂, то
одинаковый для всей цепи ток I протекает через первое из них
за счет падения на нем напряжения Е ₁ =IR ₁, а через второе — за
счет Е ₂ =IR₂. Полное напряжение по всей электрической цепи
Е=Е ₁ +Е ₂. Если R ₁ сильно отличается от R ₂, то и Е ₁ также от-
личается от E ₂. При изменении сопротивлений двух участков рас-
пределение напряжений на них может существенно измениться,
оставаясь в сумме своей неизменным.

Такая ситуация может возникать в ПААГ, состоящем из двух
последовательно расположенных участков, где при полимериза-
ции были использованы разные буферы (содержащие ионы с
разной подвижностью или просто различающиеся по концентра-
ции). Сопротивления этих участков могут оказаться разными:
следовательно, различными могут быть и падения напряжения
на них, но эти параметры зависят от длины участков. Однако
заведомо будут различаться в рассматриваемом случае значе-
ния напряженности поля на двух участках. Действительно, па-
дение напряжения на участке пропорционально его сопротив-
лению, а следовательно, длине участка. Напряженность же поля
есть результат деления падения напряжения на длину, поэтому
соотношение напряженностей поля на двух участках геля не за-
висит от их длины и определяется только концентрациями и под-
вижностями содержащихся в них ионов. Это — очень важный
вывод. В реальных буферных системах геля такую ситуацию
можно себе представить в двух простейших вариантах.

Вариант 1. Предположим, что буферы и, соответственно,
ионы на двух участках геля (A и В) одинаковы, но концентра-
ция буфера на участке A в 10 раз меньше. Это приведет к тому,
что напряженность поля в А будет вдесятеро больше, чем в В.
Скорость миграции ионов пропорциональна напряженности поля,
и ионы на участке А будут мигрировать в 10 раз быстрее, чем
такие же ионы на участке В; это компенсирует разницу в их

концентрациях. Число ионов, проходящее за 1 с через любое се-
чение обоих участков, а также через границу между ними, будет
одинаковым, что и означает неизменность тока I по всей длине
составного (ступенчатого) геля. При этом предполагается, что
количество ионов в A не истощается — оно пополняется за счет
ионов, поступающих из электродного буфера.

Вариант 2. Теперь допустим, что концентрации ионов на обо-
их участках одинаковы, но ионы на участке A отличаются на-
много меньшей электрофоретической подвижностью. Речь идет
о подвижности в свободной жидкости (u ₀), так как сетка геля
не препятствует миграции малых ионов. Например, пусть в геле
A содержатся отрицательные ионы глицина (при щелочном рH),
а в геле В — ионы хлора. Меньшая подвижность ионов обуслов-
ливает большую величину сопротивления. Суммарное напряже-
ние распределится между участками A и B так, что напряжен-
ность поля в A будет соответственно выше, причем именно на-
столько, чтобы скорость миграции ионов глицина, пропорцио-
нальная произведению подвижности на напряженность поля,
стала точно такой же, как и у ионов хлора. Этого опять требует
условие неизменности величины тока вдоль всего геля.

В более сложных случаях могут различаться как подвижно-
сти ионов, так и их концентрации, но в любом случае напряжен-
ности электрического поля в двух последовательно расположен-
ных участках геля устанавливаются такими, что они компенси-
руют все различия и обеспечивают постоянство тока во всем
геле. Значения напряженности могут при этом оказаться очень
разными. Очень важно, что это различие существенным образом
влияет и на соотношение скоростей миграции одних и тех же
белков (или нуклеиновых кислот) в двух участках геля. На "ом
участке, где напряженность поля выше, белки будут двигаться
быстрее, чем на соседнем. Эта любопытная ситуация будет рас-
смотрена ниже при обсуждении проблемы сужения белкоых
зон для противодействия диффузии. В заключение заметим, что
сам процесс электрофореза в рабочем геле следует вести в од-
нородном по напряженности электрическом поле, чтобы разде-
ление белков отражало истинное различие их собственных ха-
рактеристик — молекулярных масс и электрического заряда.

Выбор буфера рабочего геля

Вернемся к зависимости тока и напряженности поля в геле от
природы и концентрации рабочего буфера. Заметим сразу, что
сама по себе величина рН практически не сказывается на элект-
ропроводности геля. Даже при рН 4 концентрации протонов
(0,1 мМ) не даст заметного вклада в электропроводность по
сравнению с ионами буфера, концентрация которых, как будет
видно дальше, как минимум в 100 раз выше. То же относится и
к ионам ОН^– в реально используемом диапазоне рН щелочных
буферов.

В то же время косвенным образом выбор рН может сильно
влиять на электропроводность данного буфера, определяя сте-
пень диссоциации его ионов. Рассмотрим широко используемый
Трис-НСl-буфер. В нем всегда находятся ионы Трис⁺, С1^– и не-
заряженные молекулы Триса. Для этого буфера р K _a= 8,1. Это
означает, что при рН 8,1 ровно половина молекул Триса несет
положительный заряд, практически целиком за счет протонов
соляной кислоты, которой титровали буфер. Очевидно, что в рас-
творе находится такое же количество ионов С1^–. Таким образом,
при рН 8,1 0,1 М Трис-НСl содержит 0,05 М Трис⁺ и 0,05 М С1^–.
Электропроводность этого буфера будет определяться, в основ-
ном, ионами С1^–, так как их подвижность намного выше, чем у
тяжелых ионов Трис⁺. 0,05 М С1^– обеспечивает достаточно вы-
сокую электропроводность. Трис-ацетатный буфер такой же
концентрации и рН имеет значительно меньшую электропровод-
ность, так как подвижность аниона СН₃СОО^– явно ниже, чем
С1^–.

При рН 6,7 электропроводность 0,1 М Трис-НСl увеличится
примерно вдвое, так как этот рН лежит вблизи границы буфер-
ной емкости Триса и почти все его молекулы будут ионизирова-
ны; следовательно, концентрация С1^– составит около 0,1 М. На-
оборот, при рН 8,9 электропроводность этого буфера значитель-
но ниже, чем при рН 8,1, так как для титрования до рН 8,9 по-
требуется заметно меньше НС1.

Существенную роль в определении электропроводности иг-
рает выбор природы буфера, т. е. характера его ионов. Легко
понять, что К- или Nа-фосфатные буферы, как и Трис-НСl, от-
личаются высокой электропроводностью за счет ионов К⁺ и
Nа⁺. То же относится к К- или Nа-ацетатным буферам. Между
тем электрофорез в чистой уксусной кислоте умеренной концент-
рации не связан с высокой электропроводностью. Имидазол-фос-
фатный буфер той же молярности, что и К-фосфатный, отлича-
ется меньшей электропроводностью. Относительно низкую
электропроводность имеют Трис-боратный, Трис-глициновый и
Трис-барбитуратный буферы. Вообще, можно утверждать, что
электропроводности буферных систем, в которых не участвуют
легкоподвижные ионы сильных неорганических кислот и щело-
чей, относительно невелики. Это важное заключение будет иг-
рать существенную роль в дальнейшем изложении. К сожале-
нию, такие буферы нередко отличаются и меньшей емкостью.

Таким образом, электропроводность рабочего буфера опре-
деляется тремя факторами: концентрацией, необходимой для
поддержания нужного рН в белковых зонах, степенью диссоциа-
ции буферных веществ при этом рН и характером участвующих
в диссоциации ионов.

Очевидно, что буфер геля не должен содержать посторонних
солей даже в малых концентрациях. Соль, зачастую присутству-
ющую в исходном препарате, несмотря на его малый объем, сле-
дует предварительно удалить или хотя бы снизить ее концентра-

цию до 0,05 М. На избыток соли в препарате указывает, между
прочим, размытый характер передней границы и резкая задняя
граница полосы препарата сразу после его вступления в гель.
При нормальном разделении должна иметь место как раз об-
ратная картина — резкая передняя и более диффузная задняя
граница полосы. Это можно проконтролировать путем окраши-
вания пробного геля через 20 — 30 мин после начала электрофо-
реза или при использовании люминесцентных маркеров (см.
ниже).

Помимо суммарной электропроводности, определенную роль
играет электрофоретическая подвижность ионов буфера, мигри-
рующих в том же направлении, что и разделяемые макромоле-
кулы. Качество полос выигрывает, если эти ионы по своей под-
вижности приближаются к самим макромолекулам. Таковы
большие органические ионы: Трис⁺ (катион), остатки барбиту-
ровой и какодиловой кислот (анионы) и такие цвиттерионы, как
глицин и аланин. Следовательно, при прочих равных условиях
Трисовый буфер следует предпочесть при фракционировании ще-
лочных белков, а барбитуратный — для кислых белков вблизи
нейтральной области рН буфера.

Познавательные статьи:



Техника прыжка в длину с разбега

Организация работы процедурного кабинета

Области применения синхронных машин

Оптимизация по Винеру и Калману