Изолирование морфина из тканей внутренних органов.

↑

▷ Содержание

⇐ ПредыдущаяСтр 29 из 59Следующая ⇒

25 г мелко измельчённой ткани печени или почек (размер частиц не более 0,5-1 см) помещают в колбу со шлифом вместимостью 400 мл, добавляют 10 мл воды и 2,5 мл концентрированной соляной кислоты. Колбу герметично закрывают и автоклавируют при давлении 1,1 атм в течение 30-45 мин, затем охлаждают, переносят в делительную воронку и промывают дважды порциями по 100 мл петролейного эфира (t кип. 30-60⁰С) для освобождения от липидов и жиров. Солянокислый экстракт фильтруют через бумажный фильтр, остаток органов промывают дважды 3% раствором соляной кислоты, снова фильтруют. Для фильтрования можно использовать стеклянные фильтры №3 или №2 укреплённые в колбу Бунзена, с использованием водоструйного насоса. Дальнейшее исследование проводят аналогично исследованию мочи.

Идентификация

Спектрофотометрическое исследование

В УФ-области спектра на спектрофотометре в диапазоне длин волн 230-330 нм исследуют 3 мл солянокислого реэкстракта 0,1 Н раствора соляной кислоты. Морфин в солянокислом растворе имеет максимум поглощения при длине волны 284-287 нм. К солянокислому раствору в контрольной кювете и кювете с исследуемым образцом добавляют по 4 капли 30% раствора гидроксида натрия, перемешивают и исследуют спектр поглощения. В присутствии морфина максимум поглощения смещается к длине волны 296-298 нм и появляется второй максимум при длине волны около 250 нм. Такое смещение характерно для натриевых солей фенолов. Предел обнаружения морфина по характерному спектру поглощения солянокислого реэкстракта составляет около 40-50 мкг/ мл морфина.

Щелочной раствор из кюветы переносят в колбу с солянокислым реэкстрактом, водный раствор подщелачивают сухим карбонатом натрия до рН 8,7-8,8 и экстрагируют двумя порциями по 10 мл смеси хлороформ - изопропанол (8:2). Органическую фазу фильтруют через безводный сульфат натрия, доводят до объёма 20 мл; 1 мл извлечения соответствует 1 мл мочи, 1 г печени или почки. Хлороформный раствор делят на следующие аликвоты: первая – соответствующая 0,1 мл мочи или 0,1 г органа и четыре аликвоты соответствующие 4 мл мочи (или 4 г органа). Полученные остатки исследуют в тонких слоях сорбентов следующим образом: (см. табл. 1 и 2).

ТСХ исследование

Аликвоту, соответствующую 0,1 мл мочи или 0,1 г органа, хроматографируют в системах растворителей, различающихся по своей полярности:

1 - толуол-ацетон-этанол-25% аммиак, (45:45:7:3);

2 - этилацетат-абсолютный этанол-25% аммиак, (18:6:2);

3 - ацетонитрил-хлороформ-этилацетат-25% аммиак, (40:30:25:5);

4 - этанол - ледяная уксусная кислота - вода, (60:30:10).

5 – ацетон – хлороформ – 25% аммиак, (24:12:1)

Таблица 1.

Величины Rf опиатов, некоторых наркотичских и некоторых лекарственных веществ при разделении их методом ТСХ на пластинках Сорбфил ПТСХ-ПА «Силуфол»

Длина пробега фронта растворителя 8-10 см. Пластинку сушат в потоке холодного воздуха и проявляют 0,5 % раствором феррицианида калия, содержащего несколько капель 10% раствора хлорида окисного железа. В зоне, соответствующей морфину, наблюдается синее окрашивание. Проявление следует осуществлять после использования именно 4-й системы растворителей.

При хроматографировании в щелочных и нейтральных системах морфин даёт слабо-фиолетовое окрашивание, исчезающее при стоянии. Нижний предел обнаружения 2-3 мкг морфина. Ярко-синее окрашивание дают фенолы, фенольные стероиды, триптамин и ароматические амины. Исследование соответствующей аликвоты указанным количествам мочи или органов исключает возможность проявления экстрактивных веществ.

При исследовании в данных условиях аликвот, соответствующих 4-5 мл мочи или 4-5 г органа, проявляются экстрактивные вещества с Rf =0,75 и Rf =0,45. Rf морфина – 0,1-0,15 (в 4-й системе).

Аликвоту, соответствующую 4 мл мочи или желчи (или 4 г органа), хроматографируют в системах 1-3 на пластинках «Силуфол», «Сорбфил». Длина пробега фронта растворителя 8-10 см. После хроматографирования пластинку сушат в потоке холодного воздуха и проявляют.

Реактивы проявления:

1. Реактив Драгендорфа в модификации Мунье [4]: раствор 1: 17 г азотнокислого висмута и 200,0 г винной кислоты растворяют в 800 мл воды; раствор 2: 160 г КI растворяют 400 мл воды. Растворы смешивают (полученный «крепкий» раствор является устойчивым несколько месяцев). Перед опрыскиванием хроматограммы к 1 мл «крепкого» раствора добавляют 9 мл 20% раствора винной кислоты.

2. Раствор 10% хлорида окисного железа: 10г хлорида окисного железа (FeCl₃) растворяют в достаточном количестве воды и доводят водой до 100 мл (реакция на фенольный гидроксил). Хроматограмму опрыскивают полученным раствором и наблюдают реакцию в течение не менее 30 минут (при приграничных концентрациях).

3. Раствор ферри-ферроцианида калия [3]: 57,7мг К₃Fe (CN)₆ и 4,9 мг К₄Fe (CN)₆растворяют в 100 мл воды (раствор хранят в холодильнике не более 1 мес. Для опрыскивания хроматограммы к 5мл основного раствора добавляют 3 мл 6% раствора гидроксида аммония и 2 мл этанола. Полученным раствором хроматограмму опрвскивают до увлажнения пластинки, нагревают при 120⁰С 2 мин., затем исследуют в УФ-свете (254-366нм). В случае морфина, а также 6-МАМ наблюдают лимонно-желтую (254нм) и ярко-голубую (366нм) флюоресценцию (образование псевдоморфина). Образование комплекса (при приграничных концентрациях) наблюдают не ранее чем через 30-40 минут. Морфин проявляется по сине-голубой, при стоянии - салатовой флуоресценции. Данная реакция достаточно специфична: не дают флуоресцирующих пятен морфинон, кодеин и его производные, дигидроморфинон, диацетилморфин, апоморфин, меперидин, метадон, апиперидин. Флуоресцирующие пятна образуют нор-морфин, п-аллил-нор-морфин, дигидроморфин, 6-ацетилморфин, наркотин, но разделяются при хроматографировании. Экстрактивные вещества, при исследовании указанной аликвоты, в зоне морфина по данной реакции флуоресцирующих пятен не образуют. Нижний предел обнаружения морфина 50-80 мкг. В случае слабой флуоресценции необходимо ещё несколько раз опрыснуть пластинку реактивом. Флуоресценция усиливается, пятна, соответствующие морфину, после проявления приобретают через сутки желтоватую окраску, заметную при дневном освещении и сохраняют свою флуоресценцию.

4. Пробу с реактивом Скотта (тиоцианат кобальта) проводят в модификации на пластинке ТСХ. Приготовление: 6,0г нитрата кобальта и 18,0г роданида калия (тиоцианата калия) растворить в 100 мл воды. голубое окрашивание дают многие алкалоиды и синететические основания (кроме никотина, анальгина, амидопирина, кофеина, бензофенонов)

5. Пробы Марки-Манделина и Марки (8): примерно 25 мл формальдегида в чашке помещали в стеклянную камеру (время насыщения не менее 30 минут). В камеру опускают хроматограмму, экспонируя ее в парах формальдегида в течение 5 минут, вынимают ее и сушат в течение 30сек при 50⁰ С. Затем опрыскивают (под тягой) или обрабатывают методом погружения концентрированной серной кислотой или концентрированной серной кислотой, содержащей ванадат аммония (проба Марки-Манделина). Наблюдают окраску пятен, отмечают их карандашом, затем погружают пластинку в воду и быстро удаляют ее. При этом окраска пятен бледнеет. Для приготовления реактива Манделина, 200 мг ванадата аммония растворяют в 350 мл 95-97% серной кислоты.

6. Реактив Мекке (раствор селенистой кислоты или селенита натрия в концентрированной серной кислоте) [7], как и реактив Марки очень чувствителен в отношении алкалоидов опия, однако обладает более высокой изби-рательностью в отношении опиатов, позволяя определять их в присутствие экстрактивных веществ. Приготовление: 0,25 г селенистой кислоты (0,34г селенита натрия) растворить в 25 мл концентрированной серной кислоты.

Таблица 2.

Реакции обнаружения опиатов, некоторых наркотических и лекарственных веществ и наблюдаемые окраски при ТСХ-анализе на пластинках Сорбфил ПТСХ-ПА в системах растворителей 1 - 5.

Примечание: Прочерк - отсутствие окрашивания; в скобках указаны пределы детектирования вещества (в мкг); * - желто-зеленая флюоресценция кодеина проявляется после обработки реактивом Марки, промывания и высушивания пластинки; ** - флюоресценция делагила проявляется в аммиачной среде без обработки ферри-ферроцианидным реактивом.

Пределы обнаружения опиатов в моче и внутренних органах методом ТСХ по разработанной методике анализа при использовании всего комплекса хромогенных реакций (при максимальной аликвоте, эквивалентной 0,5мл исследуемой мочи или 1,0 г ткани органов) составляют: для морфина - 1-5мкг/мл мочи (1-5 мкг/г ткани органов): для кодеина и героина - 1-2 мкг/мл мочи (1-2мкг/г ткани органа).

Пределы обнаружения опиатов в моче отдельными реагентами составляют: для морфина, кодеина, и героина при использовании реактива Драгендорфа - 0,5 мкг в пробе, при применении пробы Марки или Марки-Манделина - 1мкг в пробе; для морфина при обнаружении реакцией образования псевдоморфина - 1 мкг в пробе, при детектировании с хлоридом окисного железа - 2,5 мкг в пробе.

При исследовании загнившего трупного материала наряду с морфином можно обнаружить псевдоморфин, который также изолируется по описанной методике. В солянокислом растворе он имеет максимум поглощения при 261 нм, а при подщелачивании наблюдается батохромный сдвиг максимума не более, чем на 2-3 нм. Во всех описанных хроматографических системах псевдоморфин отделяется от морфина, имеет меньшую величину Rf по сравнению с морфином на 0,15-0,20, имеет голубовато-салатную флуоресценцию до проявления раствором ферри-ферроцианида калия. При проявлении реактивом Марки образуется зелёное окрашивание, всеми остальными реактивами – аналогичное морфину. Заключение об обнаружении псевдоморфина дают на основании результатов ТСХ и УФ – спектрофотометрии. Количественное определение не проводят.

Познавательные статьи:



Как правильно слушать собеседника

Типичные ошибки при выполнении бросков в баскетболе

Принятие христианства на Руси и его значение

Средства массовой информации США