Определение концентрации общего холестерола в сыворотке крови ферментативным методом

↑

▷ Содержание

⇐ ПредыдущаяСтр 6 из 13Следующая ⇒

Принцип метода: Эфиры холестерола под действием фермента холестеролэстеразы распадаются на холестерол и жирные кислоты. Холестерол окисляется холестеролоксидазой с образованием перекиси водорода. Пероксид водорода реагирует с хромогеном с образованием окрашенного вещества (хинонимин):

Интенсивность окраски раствора при длине волны 550 нм прямо пропорциональна концентрации холестерола в нем.

Линейность метода: до 19,4 ммоль/л.

Норма:

Сыворотка крови – < 5,2 ммоль/л (37°С).

Оборудование и реагенты:

1) Спектрофотометр с термостатированной кюветой, длина волны 550 нм, длина оптического пути 1 см; температура реакции 37°С;

2) Секундомер;

3) Автоматические пипетки на 10 мкл и 1000 мкл;

4) Сыворотка крови;

5) Реагент (холестеролэстераза, холестеролоксидаза ³ 50 Е/л, пероксидаза ³ 1000 Е/л, 4-аминоантипирин 0,3 ммоль/л);

6) Стандарт (Холестерол 5,2 ммоль/л);

7) Дистиллированная вода.

Проведение анализа

Перемешать содержимое каждой пробирки. Инкубировать 10 мин при температуре 37°С. Измерить оптическую плотность опытной и стандартной проб против холостой пробы при длине волны 550 нм (DА). Окраска стабильна в течение 30 минут.

Расчет

Расчет по стандарту концентрации холестерола в сыворотке проводят по формуле:

где DА_{оп / ст} – оптическая плотность опытной пробы и стандартной,

соответственно;

С_ст – концентрация стандарта (ммоль/л).

Если концентрация холестерола превышает 19,4 ммоль/л (точка вне зоны линейности калибровочного графика), анализируемый образец (сыворотка или моча) следует развести 1:1 физиологическим раствором и повторить измерение, а полученный результат расчета умножить на 2.

Клинико-диагностическое значение: Уровни холестерола важны в диагностике и классификации гиперлипопротеинемий.

Концентрация холестерина в сыворотке указывает на работу печени, билиарного тракта, всасывание в кишечнике.

Высокие концентрации холестерина говорят об угрозе ишемической болезни сердца, о нарушении тиреоидной функции и заболеваниях надпочечников.

Лабораторная работа № 10.

Определение концентрации холестерина ЛПВП в сыворотке крови

Принцип метода: Холестерол липопротеинов высокой плотности (ЛПВП) определяют после осаждения из сыворотки липопротеинов низкой и очень низкой плотности (ЛПНП и ЛПОНП, соответственно). Супернатант содержит холестерол, связанный с ЛПВП в растворенной форме и определяется ферментативным методом для определения концентрации общего холестерола.

Интенсивность окраски раствора при длине волны 550 нм прямо пропорциональна концентрации холестерола в ЛПВП.

Линейность метода: до 19,4 ммоль/л.

Норма:

Сыворотка крови – > 0,9 ммоль/л (37°С).

Оборудование и реагенты:

1) Спектрофотометр с термостатированной кюветой, длина волны 550 нм, длина оптического пути 1 см; температура реакции 37°С;

2) Секундомер;

3) Автоматические пипетки на 10 мкл, 400 мкл, 2 мл и 1000 мкл;

4) Сыворотка крови;

5) Осаждающий реагент (хлорид магния, 100 ммоль/л в ортофосфорной кислоте, 30,3 ммоль/л)

6) Реагент (холестеролэстераза, холестеролоксидаза ³ 50 Е/л, пероксидаза ³ 1000 Е/л, 4-аминоантипирин 0,3 ммоль/л);

7) Стандарт (Холестерол 1,2 ммоль/л);

8) Дистиллированная вода.

Проведение анализа

В пластиковую пробирку внести 400 мкл сыворотки и добавить 2 мл осаждающего реагента. Тщательно перемешать в течение 15 секунд. После чего центрифугировать 3000 об/мин в течение 5 минут. Отобрать 1мл супернатанта в чистую пробирку и использовать для последующего определения холестерола в ЛПВП.

Перемешать содержимое каждой пробирки. Инкубировать 10 мин при температуре 37°С. Измерить оптическую плотность опытной и стандартной проб против холостой пробы при длине волны 550 нм (DА). Окраска стабильна в течение 30 минут.

Расчет

Расчет по стандарту концентрации холестерола в сыворотке проводят по формуле:

где DА_{оп / ст} – оптическая плотность опытной пробы и стандартной,

соответственно;

С_ст – концентрация стандарта (ммоль/л).

Клинико-диагностическое значение: Содержание холестерола в ЛПВП в кови здоровых людей мало меняется с возрастом и не подвержено колебаниям.

Величины содержания холестерола в ЛПВП < 0,9 ммоль/л свидетельствуют о нарушении липидного обмена и угрозе атеросклероза. Повышение содержания холестерола в ЛПВП, как и повышение содержания общего холестерина в результате увеличения этой фракции, является доброкачественным состоянием.

ТЕМА 7. БЕЛКОВЫЙ ОБМЕН

Лабораторная работа № 11.

Познавательные статьи:



Формы дистанционного обучения

Передача мяча двумя руками снизу

Значение правильной осанки для жизнедеятельности человека

Основные ошибки при выполнении передач мяча на месте