Некоторые перспективные технологии иммуноанализа

↑

▷ Содержание

⇐ ПредыдущаяСтр 6 из 6

Иммуносенсоры (ИС)

ИС – это устройства, состоящие из специфического антигена/ антитела (датчик), связанного с преобразователем и передатчиком сигнала о связывании соответствующего лиганда (рис.13).

	Широкий спектр веществ
Специфические (рекомбинантные) антигены / моноклональные антитела
Выделяют четыре типа передатчиков: · измерители электрохимических процессов (потенциометрия, амперометрия); · измерители массы (пьезоэффект); · измерители тепла (колориметрия); · измерители оптических свойств
Количественный результат может быть получен в режиме реального времени

Рисунок 13. Блок-схема работы иммуносенсоров

Непрямые ИС – основаны на использовании меченых компонентов для обнаружения связывания (флуоресценция, хемолюминесценция).

Прямые ИС обнаруживают связывание по переносу электронов, выделению или поглощению газов, разности потенциалов, сопротивления, массы, температуры или изменению оптических свойств и т.д. Прямые ИС можно применять для отслеживания реакции антиген – антитело в режиме реального времени.

Потенциально данный подход позволяет определять широкий спектр веществ в концентрации от 10^-9 – 10^-13 М/л и выше.

Основные преимущества ИС:

· отсутствие необходимости в применении меченых лигандов;

· возможность многократного использования;

· возможность мониторирования (получения результатов в реальном времени); высокая чувствительность и специфичность

· технологичность и возможность массового производства.

В настоящее время ИС считаются перспективным направлением иммуноанализа, однако на практике существует весьма ограниченное количество коммерческих тест-систем.

Микроэррей (МЭ)

МЭ (microarrey) является сравнительно новым (разработан в 1990-х годах) и весьма перспективным направлением в прикладной молекулярной биологии. В настоящее время наибольшее распространение получила технология микроэррея, основанная на ДНК-олигонуклеотидах, однако развивается и микроэррей с применением моноклональных антител и рекомбинантных антигенов. В частности, подобная технология применяется для диагностики и оптимизации лечения аллергий (рис. 14).

Рисунок 14. Схема проведения микроэрея для диагностики аллергии.

1. Приготовление микрочипа: раскапывание рекомбинантных аллергенов на поверхность активированного предметного стекла (объем капли - нанолитры, количество антигена - десятки пикограмм). Одно стекло содержит 12 ячеек. Каждая ячейка содержит десятки (сотни) различных аллергенов и калибровочную кривую (возрастающие количества IgE) в триплетах. Таким образом, одновременно можно обследовать до 12 пациентов.

2-3. Ход теста:

· раскапывание сывороток пациентов (15 мкл);

· инкубация (IgE пациента соединяются с аллергенами)

· добавление моноклональных антител против IgE, меченных флуорохромом;

· сканирование микрочипа:

· типичная сканограмма микрочипа:

· первые три ряда = калибровочная кривая (интенсивность свечения пропорциональна количеству фиксированных IgE);

· далее профиль сенсибилизации пациента (специфичность и количество IgE в сыворотке пациента).

Аналогичные микроэрреи применяются для обнаружения и исследования аутоантител против различных компонентов (антигенов) соединительной ткани при системных аутоиммунных заболеваниях (ревматоидный артрит, системная красная волчанка и др.).

Обратная техника (фиксация набора моноклональных антител на стекле) используется для анализа белков, полисахаридов, биологически активных соединений, медикаментов, токсинов и др. в составе клинических образцов, причем можно анализировать не только растворы, но и суспензии клеток (точная диагностика (фенотипирование) лейкозов).

Иммунохроматографический анализ (ИХА)

ИХА (предложен в начале 1980-х гг.) можно отнести к группе реакций с мечеными антителами. В качестве метки используют окрашенный латекс или частицы коллоидного золота.

Типичный тест представляет собой пластиковую пластинку и содержит окно для внесения материала, окно для учета результата и одно или несколько окон для внутреннего контроля/контролей (рис. 15).

В реакции используют:

· первые антитела к искомому антигену, иммобилизованные в виде полосы на хроматографическом носителе в окне для учета результата (выше окна для внесения материала);

· вторые антитела к тому же антигену, адсорбированные на микрочастицах золота или латекса (размещаются в окне для внесения материала).

Внутренний контроль/контроли включают:

· выявляемый антиген, нанесенный после окна для учета результата (положительный контроль, контроль протекания всех этапов основной реакции);

· антивидовые антитела против вторых (меченых) антител, закрепленные в виде полосы на носителе (отрицательный контроль, контроль переноса ингредиентов по носителю, адекватность внесения материала);

· неспецифические первые антитела (того же происхождения) (контроль специфичности связывания вторых антител).

Постановка теста на примере системы для диагностики инфекционного мононуклеоза (рис. 16):

Подготовленный исследуемый материал в небольшом количестве (5-7 капель) вносится в стартовое окно тест-системы. Здесь происходит взаимодействие антигена с антителами, адсорбированными на частицах, и начинается движение образовавшихся комплексов за счет капиллярности носителя. Дойдя до антител, расположенных на носителе в окне учета результата, эти комплексы связываются, при этом частицы латекса или коллоидного золота проявляются в виде линии голубого (латекс) или (коричневого) цвета. Поскольку частицы, нагруженные, антителами берутся в избытке, часть их движется дальше и связывается в окне (окнах) внутреннего контроля реакции. Полоса в этом окне свидетельствует о правильной работе тест-системы.

Забор материала	Внесение материала	Учет результата через 5 минут
Рисунок 16. ИХА система для диагностики инфекционного мононуклеоза

В настоящее время разработаны тест-системы для установления овуляции и беременности, выявления стрептококков группы А в мазках из зева, вирусов грипа А и В и РС-вируса в соскобах и смывах из носоглотки, возбудителей туберкулеза в мокроте, хламидий в соскобах из уретры и шейки матки, токсина C.dificile в испражнениях, вируса Эпштейн-Барр в крови, определения маркеров повреждения миокарда (инфаркт миокарда), патологического свертывания крови (тромбоз), нарушения обмена кальция (остеопороз) и др.

ИХА может использоваться как для экспресс-индикации антигенов в пробе, так и для идентификации выделенных культур. Например, ИХА позволяет проводить обнаружение листерий в исследуемом материале непосредственно в среде обогащения, без выделения чистой культуры. Это позволяет сократить время исследования до 48 часов.

Таким образом, ИХА тест-системы обладают несомненными достоинствами:

· высокой специфичностью,

· скоростью получения результата,

· доступны, легко интерпретируются,

· не требуют медицинской или лабораторной квалификации,

· могут применяться пациентами самостоятельно в любых условиях.

Однако по чувствительности ИХА системы уступают другим методам иммуноанализа, что позволяет применять их лишь в качестве ориентировочного теста. Существует также проблема документирования результатов и ряд этических проблем, связанных с самостоятельным применением тестов пациентами.

Список литературы

Антитела. Методы. В 2-х кн. Кн. 2: Пер. с англ./Под ред. Д.Кэтти. – М.: Мир, 1991. – 384 с.

Иммуноферментный анализ: Пер. с англ./Под ред. Т. Нго и Г. Ленхоффа.- М.: Мир, 1988. – 446 с.

Манолов А. Твердофазные радиоиммунные методы для количественного экспресс-анализа в микробиологии //ЖМЭИ, 1985, N:4, с.100-107.

Теория и практика иммуноферментного анализа/ А.М. Егоров, А.П. Осипов, Б.Б. Дзантиев, Е.М. Гаврилова – М.: Высш. шк., 1991. – 288 с.

Тертон М., Бангхем Д.Р., Колкотт К.А. и др. Новые методы иммуноанализа: Пер с англ. – М.: Мир, 1991. – 280 с.

Birjis Chinoy, Edgar Yee, Sami L Bahna Skin testing versus radioallergosorbent testing for indoor allergens//Clinical and Molecular Allergy2005, 3:4.

C. Harwanegg, R. Hiller Protein microarrays for the diagnosis of allergic diseases: State-of-the-art and future development// J Lab Med 2005, 29(4): 272–277.

C. L. Morgan, D. J. Newman, C. P. Price Immunosensors: technology and opportunities in laboratory medicine//Clinical Chemistry 1996,42:2.- P.193-209.

Clinical chemistry, 1990,36/8, 1408-1427.

Immunoassay of infectious agents/ P. E. Andreotti, G. V. Ludwig, A. H. Peruski //BioTechniques 2003,35: P. 850-859.

J. P. GoslIng A Decade of Development in Immunoassay Methodology// Clinical Chemistry, 1990, Vol.36, No. 8, P. 1408.

L. J. Kricka Miniaturization of analytical systems//Clinical Chemistry, 1998,44:9, P. 2008–2014.

L. J. Kricka Selected Strategies for Improving Sensitivity and Reliability of Immunoassays//Clinical chemistry, 1994, 40/3, P. 347-357.

Immunochemical staining methods / S.J.Naish, T.Boenisch, A.J.Farmilo, R.H.Stead//DAKO Corporation, Carpinteria, California, 1989. – P.41.

Methods of Biomaterials Testing // http:\\www.manfred.maitz-online.de

Microarrayed recombinant allergens for diagnostics of allergy/Harwanegg C., Laffer S., Hiller R et al. //Clin. Exp. Allergy 2003, 33: 7- 13.

R Spiewak ELISpot: Principles of the technique//www.ELISpot.biz

R. P. Ekins Ligand assays: from electrophoresis to miniaturized microarrays//Clinical Chemistry, 1998; 44: 2015-2030.

Radioallergosorbent Test (RAST) Methods for Allergen-Specific Immunoglobulin E (IgE) 510(k)s; Final Guidance for Industry and FDA / U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug Administration;Center for Devices and Radiological Health.- August 22, 2001.

Radioimmunometric Assay for a Monoclonal Antibody-Defined Tumor Marker, CA 19-9/ Villano B. C., Brennan S., Bucher C. et al.// Clinical Chemistry,1983, Vol. 29, No. 3, 1983 549-552.

http://biotech.city.tomsk.net/assay/assay.htm – сайт Томского медицинского университета

Оглавление

Учебное издание

Черношей Дмитрий Александрович, Канашкова Татьяна Александровна

Познавательные статьи:



Психологические особенности спортивного соревнования

Приготовление дезинфицирующих растворов различной концентрации

Занятость населения и рынок труда

Социальный статус семьи и её типология