Сравнительные оценки целлюлозного сырья для производства биоэтанола второго поколения

Цель исследования: Оценка извлечения сахара и ферментативности восьми лигноцеллюлозных сырьевых материалов после предварительной обработки слабой кислотой и ферментативного гидролиза с использованием рекомбинантного штамма Zymomonas mobilis.

Методы и результаты: предварительная обработка разбавленной кислотой (2% H2SO4) с 10% (w⁄ v) загрузкой субстрата проводилась при 134C в течение 60 мин с последующим ферментативным гидролизом при 60C. результаты показали, что гидролиз травянистого сырья приводил к более высокой степени извлечения сахара (до 60-75%), чем древесные источники (<50%). Исследования ферментации с рекомбинантным Z. mobilis ZM4 (pZB5) показали, что конечные концентрации этанола и выходы были также выше для травянистых гидролизатов. Значительное снижение темпов роста и удельных показателей поглощения сахара и производства этанола произошло для всех гидролизатов, причем наибольшее снижение было отмечено для древесных гидролизатов. Дальнейшие исследования по оптимизации ферментативного гидролиза показали, что при 50 ° с достигается более высокая степень извлечения сахара по сравнению с 60 ° С после кислотной предварительной обработки.

Выводы: из различных видов оцениваемого сырья наибольшие выходы этанола и продуктивность были достигнуты при использовании гидролизатов соломы пшеницы и сахарного тростника. Солома сорго, верхушки сахарного тростника и гидролизаты Arundo donax были схожи по своим характеристикам, в то время как ферментация древесных гидролизатов (масло моли, сосны и эвкалипта) приводила к относительно низким концентрациям этанола и продуктивности. В различных гидролизатах были определены концентрации ряда ингибирующих соединений, которые могут оказывать влияние на кинетику ферментации.

Значение и влияние исследования: основное внимание в исследовании уделяется лигноцеллюлозным материалам, доступным для ферментации этанола второго поколения, предназначенным для использования возобновляемой сельскохозяйственной и лесной биомассы, а не пищевых ресурсов. Из полученных результатов видно, что относительно хорошие урожаи сахара и этанола могут быть получены из некоторых видов травянистого сырья (например, сахарного тростника и соломы сорго), в то время как гораздо более низкие урожаи были получены из древесной биомассы.

Вступление

Лигноцеллюлозное сырье может служить альтернативным сырьем для устойчивого производства биоэтанола и других биохимических продуктов с широким спектром экономических и экологических выгод (Hahn-Hagerdahl et al. 2007; Thomsen and Haugaard-Nielsen 2008; Soetaert and Vandamme 2009). Целью настоящего исследования является сравнительная оценка восьми различных лигноцеллюлозных сырьевых материалов на предмет их пригодности для производства биоэтанола. Такое сырье является основой для ферментационных процессов второго поколения, предназначенных для использования возобновляемой сельскохозяйственной и лесной биомассы, а не пищевых ресурсов (Himmel et al. 2007; Scharlemann and Laurance 2008; Williams et al. 2008; Hayes 2009). Рекомбинантный штамм Zymomonas mobilis, способный превращать как ксилозу, так и глюкозу в этанол (Zhang et al. 1995) был использован, поскольку предыдущие исследования показали, что Z. mobilis способен к высоким удельным скоростям производства этанола, а также к высоким выходам этанола и продуктивности (Rogers et al. 2007). Недавний отчет об улучшенной аннотации генома для Z. mobilis (Yang et al. 2009), основанный на более раннем исследовании Seo et al. (2005), обеспечивает отличную базу данных для дальнейших генетических манипуляций и повышения штаммов этого микроорганизма. Концентрации потенциальных ингибиторов были определены также для различных видов сырья, используемых в данном исследовании. Такая информация позволяет выявить возможные причины снижения продуктивности ферментации, а также потенциальные мишени для дальнейшего усиления штамма (Joachimsthal et al. 1998; Kim et al. 2000a; Jeon et al. 2002; Pienkos and Zhang 2009; Yang et al. 2010а).

Материалы и методы

Анализ сырья и состава

Солома сорго (Sorghum bicolor), пшеничная солома (Triticum aestivum), багасса сахарного тростника и верхушки сахарного тростника (SCT) (Saccharum officinarum) были получены от местных фермеров. Эти сорта типичны для Австралии и выращивались с использованием традиционных методов ведения сельского хозяйства. Древесина лиственных пород (эвкалипт dunnii) и щепа хвойных пород (Pinus elliotii) были пожертвованы лесным хозяйством Нового Южного Уэльса. Эвкалипт loxophleba ssp. lissophloia (oil mallee) была подарена Департаментом окружающей среды и охраны окружающей среды (Западная Австралия). Арундо донакс был подарен Южноавстралийским научно-исследовательским институтом (SARDI, Южная Австралия). Образцы биомассы анализировали на целлюлозу, гемицеллюлозу и лигнин с использованием метода детергентных волокон (Van Soest et al. 1991). Содержание целлюлозы и гемицеллюлоз в различных образцах биомассы приведено в Таблице 1; эти значения находятся в пределах диапазонов для целлюлозы и гемицеллюлоз, указанных в работе Pienkos and Zhang (2009).

Предварительная обработка

Весь биомассный материал сушили при температуре 55-60С в течение 48 ч, измельчали и мелко измельчали с помощью микро-молотковой мельницы (Culatti AG, Цюрих, Швейцария), а затем пропускали через сито диаметром 1Æ5 мм. Измельченный материал хранили при комнатной температуре в герметичных контейнерах. Для оценки выхода сахара из гемицеллюлозной и целлюлозной фракций проводили предварительную обработку разбавленной кислотой в 2% H2SO4 (v ⁄ v) с 10% (w⁄ v) сырьем при температуре 134С в течение 60 мин. Перед ферментативным гидролизом рН предварительно обработанных кислотой гидролизатов доводили до 5Æ0 добавлением твердого Ca (OH) 2. Температура для фермента гидролиза изначально был выбран при 60С, чтобы максимизировать б-глюкозидазы деятельности в качестве оптимальной температуры для целлюлазы (NS50013; компания Novozymes, территории природного заповедника васерне, Дания) и β-глюкозидазы (NS50010; компания Novozymes) наблюдалось в диапазоне 45–60оС и 45–70С, соответственно, в соответствии с инструкцией производителя. Ферментативный гидролиз проводили при 60С с встряхиванием при 180 об / мин) 1 в течение 22 ч. Для сравнения дальнейшие исследования влияния температуры на ферментативный гидролиз и выделение сахара проводили при 50С. В обоих исследованиях использовали 2% (v ⁄ v) целлюлазу и 4% (v ⁄ v) b-глюкозидазу, причем последняя была разработана для полного высвобождения глюкозы. Новозим 50013 содержал 700 ЭГУ (эндоглюканазная единица) г)1 общей целлюлазы; активность b-глюкозидазы Новозима 50010 составляла 250 КБУ (целлобиазная единица)г) 1. Извлечение сахаров ( % ) рассчитывали из общего количества сахаров в конечных образцах кислотно-ферментного гидролизата и сравнивали с общим количеством доступных сахаров на основе анализа сухого веса (табл.1).

Штамм микроорганизмов для производства этанола

Рекомбинантный штамм Zymomonas mobilis ZM4 (pZB5) (Zhang et al. 1995; Joachimsthal and Rogers 2000) был использован в тестах ферментируемости. Рекомбинантный штамм, который может использовать как ксилозу, так и глюкозу для производства этанола, был любезно предоставлен доктором мин Чжаном, Национальной лабораторией возобновляемых источников энергии, Golden, Co. по Договору о передаче материалов. Штамм обычно культивировали при 30С на агаровых пластинах, содержащих 20 г л) 1 ксилозу, 5 г л)1 дрожжевой экстракт и 20 ЛГ мл)1 тетрациклин.

Исследования ферментации

Кислотные гидролизаты, обработанные ферментами, доводили до рН 5 с использованием 3 моль л) 1 NaOH. Для отделения жидкой фракции твердую фракцию [негидролизованное волокно и гипс (CaSO4)] удаляли центрифугированием при 7000 g в течение 20 мин. Инокуляты для ферментации готовили путем нанесения покрытия Z. mobilis ZM4 (pZB5) из замороженных культур на агаровые пластины (состав описан ранее). Отбирали одну колонию и использовали для инокуляции 10 мл первой семенной среды, состоящей из 25 г ксилозы, 10 г дрожжевого экстракта и базальных минералов (1 г MgSO4Æ7H2O; 1 г (NH4)2SO4; 2 г KH2PO4). При достижении оптической плотности A660 = 0Æ8-1Æ0 использовали 1% (v ⁄ v) аликвоту для инокуляции второй семенной среды, состоящей из гидролизатов кислых ферментов с добавлением дополнительных питательных веществ на литр: глюкозы 2Æ5 г, ксилозы 12Æ5 г, дрожжевого экстракта 2Æ5 г и базальных минералов (концентрации, описанные ранее). Когда была достигнута дальнейшая оптическая плотность A660 = 0Æ8–1Æ0, для инокуляции основной среды брожения использовали 10% (v ⁄ v) аликвоты второй культуры семян. В его состав входили кислотно-ферментные гидролизаты, дополненные дрожжевым экстрактом (5 г л)1 ). Для поддержания плазмиды все среды включали 20 мг л) 1 тетрациклин. Ферментацию проводили в 100-мл колбах Эрленмейера с рабочим объемом 50 мл. Порционные посевы проводили при температуре 30С и начальном рН 5Æ0 без перемешивания. Пробы отбирали через различные промежутки времени для определения концентрации биомассы, ксилозы, глюкозы, арабинозы и этанола.

Аналитическая процедура

Кислота ⁄ ферментный гидролизат образцы были проанализированы для глюкозы, ксилозы и арабинозы, а также продуктов деградации, в том числе уксусной кислоты, фурфурола, hydroxymethylfuraldehyde (ВПФ), levulinic кислоты и формиата методом ВЭЖХ с использованием колонки Aminex HPX по-87х годах (300 · 7Æ8) (Биорадиационное, Ричмонд, Калифорния, США), оборудованный детектором показателя преломления и компьютером сопряжена электронный интегратор. Разделение проводили при 50С и элюировали при 0Æ6 мл мин) 1 с использованием 5 ммоль л) 1 H2SO4. Рост измеряли мутнометрически при 660 Нм (1 см светового пути). Массу сухих клеток определяли путем преобразования значений оптической плотности при 660 Нм в массу сухих клеток с использованием константы преобразования массы сухих клеток для ZM4 (pZB5) (OD660nm 0Æ05 = 15 мг л)1) (Kim et al. 2000b). Ферментационные пробы анализировали на содержание глюкозы, ксилозы, арабинозы и этанола методом ВЭЖХ с использованием рефракционного детектора в условиях, описанных ранее. Для подтверждения точности калибровки периодически использовались стандарты, содержащие компоненты аналитического класса.

Расчет кинетических параметров

Максимальные удельные темпы роста рассчитывались в экспоненциальной фазе роста. Максимальная удельная глюкозы ставки (qsmax,глюкозы) и максимальная удельная этанола темпы производства (qpmax) были рассчитаны на экспоненциальной фазе роста на основе следующих формул: qsmax,глюкоза =(1 ⁄ демонических) (ДС⁄DT) и qpmax = (1 ⁄ демонических) (ДП ⁄DT), где DS и DP являются изменения в концентрации глюкозы и этанола соответственно, за период времени ДТ, и XAV является средняя концентрация биомассы за DT, где Х, S и P-это концентрации биомассы, глюкозы и этанола соответственно. В основной фазе утилизации ксилозы, после полного истощения глюкозы, рост был очень ограничен. На этом этапе Формулы были модифицированы следующим образом: qsmax,ксилоза = (1 ⁄ xav) (Ds⁄Dt), где Ds-изменение концентрации ксилозы в течение ее максимальной скорости поглощения за этот период времени Dt, а xav-средняя концентрация биомассы за период времени Dt. Общие выходы для производства этанола (Yp ⁄ s) на сахарных смесях основывались на начальных и конечных концентрациях биомассы, сахаров (глюкозы и ксилозы) и этанола.

Результаты

Результаты кислотно-ферментной предварительной обработки

Результаты кислотной предварительной обработки с последующим ферментативным гидролизом при 60С и РН 5Æ0 приведены в таблице 2. Результаты показывают, что предварительная обработка и ферментативный гидролиз травянистого сырья приводили к более высокому извлечению сахара по сравнению с древесным сырьем. Среди первых гидролизаты из соломы пшеницы, сахарного тростника и соломы сорго (72-74%) показали самые высокие показатели извлечения сахара. Гидролизат из A. donax (Adx) показал самую низкую степень извлечения сахара (65%) среди травянистого сырья. Древесное сырье показало более низкую степень извлечения (<55%) по сравнению с травянистым сырьем.

Влияние пониженных концентраций ферментов

Поскольку затраты на ферменты являются основным компонентом затрат на преобразование биомассы в этанол, была проведена дальнейшая оценка с 10-кратным снижением добавленных ферментов, а именно: 0Æ2% (в ⁄ в) целлюлоза и 0Æ4% (в ⁄ в) б-глюкозидазы при 60С. Однако, выяснилось, что уменьшилось фермента концентрации привела к существенному снижению урожайности восстановления сахара. В результате было решено продолжить работу с более высокими нагрузками ферментов, хотя было признано, что для определения оптимальных концентраций ферментов потребуются дальнейшие исследования ввиду высокой стоимости ферментов.

Исследования ферментации кислых ферментативных гидролизатов

Для оценки ферментируемости этих кислотных ферментативных гидролизатов были проведены исследования периодического брожения с использованием рекомбинантного штамма Z. mobilis ZM4 (pZB5). Результаты ферментационных профилей с различным сырьем приведены на рис. 1(А, В), а анализ кинетических данных приведен в таблице 3. Из таблицы 3 видно, что все гидролизаты показали значительно более низкие максимальные удельные скорости роста, поглощения сахара и производства этанола по сравнению с таковыми для глюкозо-ксилозной среды с аналогичными концентрациями сахара. Это может быть связано с низкой концентрацией основных минералов в гидролизатах (всего 5 г л)1 дрожжевой экстракт был добавлен для обеспечения необходимых витаминов и факторов роста) или с наличием ингибирующих рост соединений. Определены концентрации потенциальных ингибирующих соединений, образующихся в результате гидролиза (например, ацетата, формиата, фурфурола, ГМФ и левулиновой кислоты) (Таблица 4).

Кинетический анализ ZM4 (pZB5) в различных кислотно-ферментативных гидролизатах сырья (10% (w ⁄ v) субстрата; химическая предварительная обработка с использованием 2% H2SO4 при 134C в течение 1 ч; ферментный гидролиз с использованием 2% целлюлазы и 4% b-глюкозидазы при 60C в течение 22 ч)

Ингибирующие соединения, полученные из кислотных ферментных гидролизатов (10% w ⁄ v) различного сырья (условия предварительной обработки как в таблице 3)

Таблица 5. Производство сахара для ферментации сырья (10% w ⁄ v) от кислотно-ферментной предварительной обработки при более низкой температуре для ферментативный гидролиз

Рис. 1 (а) профили ферментации ZM4 (pZB5) в различных гидролизатах травяного сырья с использованием 2% H2SO4 при 134C в течение 1 ч; ферментный гидролиз с использованием 2% целлюлазы и 4% b-глюкозидазы при 60C в течение 22 ч. А: пшеничная солома; Б: сахарный тростник багасс; в: сорго солома; г: Арундо донакс.

Недавно сообщалось о токсическом воздействии ингибиторов, полученных в результате мягкого кислотного гидролиза лигноцеллюлозных материалов на штаммы Z. mobilis (Pienkos and Zhang 2009; Yang et al. 2010а). Хотя концентрации ингибиторов, обнаруженные в этом исследовании, были ниже минимальных ингибиторных уровней, сообщенных этими авторами, вполне вероятно, что скорость ферментации и продуктивность в этом исследовании были снижены не только отдельными соединениями,но и их комбинированным ингибирующим действием таких соединений (Palmqvist and Hahn-Hagerdal 2000a, b).

Дальнейшие исследования влияния температуры на ферментативный гидролиз Recover восстановление сахара

Поскольку оптимальная температура для ферментативного гидролиза не была определена, были проведены дальнейшие исследования по извлечению сахара с предварительной обработкой ферментом при 50С, а не 60С. Результаты этой оценки показали, что при более низкой температуре ферментативного гидролиза можно добиться увеличения выхода сахара на 5-25% (табл.5). Такие условия, вероятно, приведут к увеличению концентрации этанола в гидролизатах, и дальнейшая оптимизация концентраций ферментов и времени гидролиза, а также температуры гидролиза необходимы для достижения высоких выходов и снижения затрат на предварительную обработку.

Обсуждение и выводы

Из различных оцениваемых видов сырья наиболее высокие выходы этанола и продуктивность были определены для гидролизатов пшеничной соломы и багассы. Гидролизаты соломы сорго, SCT и A. donax (Adx) были схожи по своим характеристикам, в то время как ферментация гидролизатов древесного сырья (масличной моли, сосны и эвкалипта) приводила к относительно низким концентрациям этанола и продуктивности, причем последняя, возможно, была обусловлена более высокими концентрациями ингибирующих соединений (например, более высокими концентрациями фурфурола в масличной моли). Как сообщалось ранее (Joachimsthal and Rogers 2000; Jeon et al. 2002; Yang et al. 2010b), улучшенные штаммы Z. mobilis могут быть разработаны для частичного преодоления некоторых ингибирующих эффектов, возникающих в результате ингибирующих компонентов, таких как ацетат. Из этого исследования видно также, что для достижения значительно более высоких концентраций сахара в гидролизатах необходимы значительные НИОКР в конструкции биореактора. При концентрации сырья 10% (w⁄ v) с травянистыми материалами были достигнуты извлечения сахара 80-90% (табл.5). Однако для ферментации с высокой производительностью необходимы более высокие концентрации сахара (150-200 г л)1, и хотя концентрация биомассы до 15% (w⁄ v) может быть гидролизована в простом перемешиваемом реакторе, более высокие концентрации выше этого являются проблематичными из-за высоких уровней адсорбции воды мелкими частицами биомассы. Конструкция противоточного биореактора, оптимальные условия для кислотного ферментативного гидролиза и, возможно, более высокие рабочие температуры для кислотного гидролиза (напр. древесной биомассы), а также улучшенные микроорганизмы, устойчивые к более высоким концентрациям ингибиторов, - все это будет необходимо для дальнейшего совершенствования процесса и потенциальной коммерческой жизнеспособности (Galbe and Zacchi 2007).

Познавательные статьи:



Техника нижней прямой подачи мяча

Комплекс физических упражнений для развития мышц плечевого пояса

Стандарт Порядок надевания противочумного костюма

Общеразвивающие упражнения без предметов