Оценка эффективности анализа с использованием стандартных кривых

↑

▷ Содержание

⇐ ПредыдущаяСтр 7 из 20Следующая ⇒

Эффективность, воспроизводимость и динамический диапазон анализа SYBR Green I могут быть

определяется путем построения стандартной кривой с использованием серийных разведений известного

шаблон, как описано в разделе 1.1.3. Эффективность анализа должна быть

90–105%, R 2 стандартной кривой должен быть> 0,980 или r> | –0,990 |, а

C T значения повторов должны быть одинаковыми.

Важно отметить, что диапазон концентраций матрицы, используемых для

стандартная кривая должна охватывать весь диапазон концентраций матрицы

тестовые образцы, чтобы показать, что результаты тестовых образцов находятся в пределах линейного

динамический диапазон анализа. Если тестовые образцы дают результаты за пределами диапазона

Для стандартных кривых должно быть выполнено одно из следующих действий:

• Построить более широкую стандартную кривую, охватывающую концентрации тестируемого образца и

выполнить анализ, чтобы убедиться, что анализ является линейным в этом новом диапазоне

• Если испытуемые образцы дают более низкую C T, чем самая высокая концентрация стандартов

использовать в стандартной кривой, повторить анализ, используя разведенные образцы

• Если испытуемые образцы дают более высокий C T, чем самая низкая концентрация стандартов

использовать в стандартной кривой, повторить анализ, используя большее количество

тестовые образцы

Рис. 2.13. Анализ кривой плавления. Наличие неспецифического продукта, в данном случае праймеров-димеров,

проявляется как дополнительный пик в анализе кривой плавления. А. Отрицательная первая производная от изменения

Флуоресценция представлена ​​в зависимости от температуры. Б. Гель-анализ продуктов КПЦР. Полоса 1,

AmpliSize молекулярная линейка 50–2000 п.н.; дорожки 2 и 3, два повтора из реакции, показанной на (А).

A

В

начиная

разработка и оптимизация реакций зонда TaqMan

2.4 Разработка и оптимизация TaqMan

Зонд Реакции

В анализе TaqMan используется пара ПЦР-праймеров и двойная метка, специфичная для мишени.

флуоресцентный зонд. Шаги для разработки анализа TaqMan:

• Конструкция праймера и зонда

• Проверка достоверности и оптимизация

В разделах 2.4.1 и 2.4.2 приведены рекомендации по выполнению этих двух шагов.

Дизайн грунтовки и зонда

Как и в случае любой реакции КПЦР, анализы на основе TaqMan требуют эффективных и специфических анализов.

амплификация продукта. Правила оформления грунтовки аналогичны описанным в

Раздел 2.3.1. Как правило, грунтовки рассчитаны на температуру отжига

между 55 и 60ºC. Мы рекомендуем использовать программное обеспечение, такое как Beacon Designer

для разработки ваших праймеров TaqMan и зонда TaqMan. Потому что двойная метка

зонд является наиболее дорогостоящим компонентом анализа TaqMan, мы предлагаем вам заказать

два праймера и проверить их эффективность с помощью SYBR Green I перед заказом

зонд с двойной меткой. См. Раздел 2.3 для получения подробной информации о том, как проверить набор праймеров.

в реакции SYBR Green I.

Зонд TaqMan должен иметь Т м 5-10 ° С выше, чем у праймеров.

В большинстве случаев зонд должен быть <30 нуклеотидов и не должен содержать G в

его 5 'конец, потому что это может погасить флуоресцентный сигнал даже после гидролиза.

Выберите последовательность в пределах цели, которая имеет содержание GC 30–80%, и

проектировать зонд для отжига на нити, которая имеет больше Gs, чем Cs (поэтому зонд

содержит больше C, чем Gs).

Важным аспектом разработки зонда TaqMan является репортер и гаситель

выбор. Список часто используемых комбинаций репортеров и гасителей

показано в таблице 2.1. Мы рекомендуем использовать FAM-маркированные зонды при разработке

одноплексные реакции, потому что они недороги и легко доступны, выполняют

хорошо, и может быть обнаружен всеми инструментами, в настоящее время на рынке.

© 2006 Bio-Rad Laboratories, Inc. Все права защищены. Руководство по применению ПЦР в реальном времени

23

начиная

разработка и оптимизация реакций зонда TaqMan

© 2006 Bio-Rad Laboratories, Inc. Все права защищены. Руководство по применению ПЦР в реальном времени

24

Другим важным соображением для получения точных данных КПЦР в реальном времени является

зонд качества. Даже идеально разработанный зонд может выйти из строя, если зонд неправильно

синтезированный или очищенный. Неправильное удаление несвязанной флуоресцентной метки, неэффективно

связывание и / или плохое гашение могут давать высокий флуоресцентный фон или

шум. Низкое отношение сигнал / шум приводит к снижению чувствительности и уменьшению

линейный динамический диапазон. Два зонда с одинаковыми последовательностями и идентичными

флуорофорные метки могут быть заметно различны при синтезе различными

поставщики или даже в разное время одним и тем же поставщиком. Мы рекомендуем сохранить

аликвоты каждого зонда для прямых сравнений с вновь синтезированными зондами.

Познавательные статьи:



Формы дистанционного обучения

Передача мяча двумя руками снизу

Значение правильной осанки для жизнедеятельности человека

Основные ошибки при выполнении передач мяча на месте