Способы и особенности технологии промышленного культивирования микроорганизмов

↑

▷ Содержание

Стр 1 из 7Следующая ⇒

▷ Похожие статьи

ЛЕКЦИЯ 2.

Схема. 1. Схема оптимизации ПС.

Высоко объективным является и метод балансировки состава ПС, в основу которого заложено использование уравнения ассимиляции микробной популяции, где учитываются такие показатели:

> концентрация потребляемого субстрата;

> время потребления;

> концентрация биомассы;

> коэффициент метаболизма;

> константы скорости образования и отмирания микроорганизмов;

> концентрация субстрата в начальный момент культивирования.

Обычно при периодическом процессе культивирования большинст­во важных параметров, в том числе и концентрация питательных ве­ществ в культуральной жидкости, изменяется в течение времени. Вме­сте с тем, профили их изменения не всегда близки к оптимальным. Поэтому при подборе ПС для периодического культивирования возни­кает противоречие между необходимостью внесения в нее достаточно большого количества субстратов и ингибирующим влиянием высоких концентраций одного или нескольких элементов питания на рост мик­робной клетки и(или) биосинтез целевого продукта. Снижение кон­центрации таких субстратов в исходной ПС с последующим их добав­лением в ферментер, по определенной программе, позволяет исклю­чить ингибирование процесса в начальной фазе роста и в то же время не допустить его лимитирования в последующий период размножения микробов.

Промышленное культивирование микроорганизмов с применением активной аэрации

Процесс осуществляют в реакторах объёмом от 0,01 до 100 м³, как правило, в асептических условиях. Пустой аппарат тщательно моют, проверяют герметичность стерильность и стерилизуют острым паром. Одновременно стерилизуют все коммуникации. Затем в реактор пода­ют простерилизованную в УНСи охлажденную до 25-35°С питатель­ную среду, вносят посевной материал в количестве 5-10% объёма пи­тательной среды (0,2-0,4 млрд. живых микробных клеток в 1 мл по оптической концентрации), включают систему аэрации и перемеши­вающее устройство. Так, например, для листерий и сальмонелл ско­рость вращения механической мешалки составляет 150-180 об/мин, а культура микробов аэрируется подогретым до 37°С очищенным, сте­рильным воздухом с коэффициентом подачи 1,5 л воздуха на 1 л среды в одну минуту. Коэффициент заполнения реактора обычно 0,5-0,8.

Превышение этой величины может привести к значительному уносу пены с отходящим воздухом и нарушению асептических условий.

Температуру культивирования поддерживают путём подачи охла­ждающей воды в рубашку и другие теплообменные устройства аппа­рата.

Оптимальная температура для разных микроорганизмов различна, обычно от 25 до 37°С.

Для регулирования рН культуральной жидкости в ходе культиви­рования добавляют соответствующие титрующие агенты (щёлочи, ки­слоты, раствор аммиака и др.). Продолжительность выращивания мик­роорганизмов в культиваторе 18-24 ч, спорообразующих - 40-48 ч и 200-250 ч - для актиномицетов и микроскопических грибов.

Процесс культивирования контролируют по показателям приборов - изменение температуры, рН, расход воздуха, частота вращения ме­шалки, а также путём периодического отбора проб (через 1-12 ч в зависимости от длительности процесса).

В отобранных пробах определяют содержание углеводов, общего и аммонийного азота, фосфора, биомассы, целевого продукта метабо­лизма, морфологию микробных клеток, наличие посторонней микро­флоры.

ЛЕКЦИЯ 2.

СПОСОБЫ И ОСОБЕННОСТИ ТЕХНОЛОГИИ ПРОМЫШЛЕННОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ

Для осуществления любого биотехнологического процесса необхо­димы:

^ культура микроорганизмов;

^ питательная среда;

^ аппаратура для выращивания и проведения вспомогательных операций;

^ средства контроля и управления.

Культивирование является основной стадией технологического процесса и во многом определяет количественные и качественные ха­рактеристики производства биопрепаратов. На стадии культивирования осуществляется накопление как самой биомассы, так и продуктов метаболизма (жизнедеятельности) микро­организмов.

Иногда, например, при производстве бактериальных препаратов, целевым продуктом является сама биомасса, в других случаях продук­ты, синтезируемые клеткой - антибиотики, ферменты, аминокислоты и др. При этом синтезируемый продукт может накапливаться как внутри клеток, так и выделяться в культуральную жидкость.

В том случае, когда культура растет на поверхности жидкой или плотной питательной среды, потребляя содержащиеся в ней субстраты и выделяя в эту среду продукты метаболизма, такой способ культиви­рования называют поверхностным.

При твердофазном культивировании клетки растут на поверхности твердой (плотной) среды, содержащей достаточное количество влаги и питательных веществ (чаще всего основу такой среды составляют пшеничные отруби).

При жидкофазном (глубинном) культивировании, микроорганизмы распределяются по всему объекту жидкой питательной среды, а ки­слород поступает к клеткам в результате интенсивной операции пере­мешивания.

Последний способ наиболее широко применяется в настоящее вре­мя в производстве большинства препаратов по следующим причинам:

1. Позволяет получить большое количество бактериальной массы за короткое время. Так, при культивировании микроорганизмов группы кишечной палочки в условиях состояния покоя количество микробов не превышает 1-2 млрд см ^-3, а с применением принудительной аэра­ции урожайность, в зависимости от состава питательной среды, дости­гает 50 - 60 млрд см^-3. Это объясняется тем, что при аэрации практи­чески отсутствует начальная стационарная фаза, и бактерии сразу на­чинают интенсивно размножаться, переходя в логарифмическую фазу.

2. Процесс легко управляем. При глубинном выращивании имеются существенные различия в степени потребления углеродных и азоти­стых веществ. Они интенсивно потребляются при аэрации культураль-ной жидкости, поэтому, чтобы процесс роста и размножения не пре­кращался быстро, нужно в процессе культивирования дополнительно вводить углеродные и азотистые соединения, а при необходимости и другие стимуляторы роста микроорганизмов.

Добавление питательных веществ, особенно углеводных (глюкоза) и биологических стимуляторов усиливает интенсивность размноже­ния, что и приводит к увеличению концентрации микроорганизмов в момент съема их биомассы. Данный способ также позволяет легко корректировать рН среды в процессе культивирования, что очень важ­но для достижения максимальной интенсивности размножения.

3. Максимальная технологичность. Так, поверхностный метод ме­нее технологичен и в промышленных условиях применяется в исклю­чительных случаях, когда нельзя воспользоваться глубинным методом.

Технологический процесс глубинного выращивания микроорга­низмов в реакторах (ферментерах) так же как и при использовании плотных питательных сред, складывается из следующих этапов:

1. Отбор штаммов микроорганизмов и работа с ними.

2. Приготовление посевной микробной культуры.

3. Приготовление и стерилизация питательных сред.

4. Подготовка биореактора к посеву.

5. Выращивание микроорганизмов в реакторе и контроль над про­цессом культивирования.

Кроме того, он включает ряд вспомогательных операций:

> стерилизацию оборудования и коммуникаций;

> приготовление и стерилизацию пеногасителей, растворов и др. Остановимся на каждом из этапов культивирования.

1.1. ОТБОР ШТАММОВ МИКРООРГАНИЗМОВ И РАБОТА С НИМИ

Эталонные, или референтные, штаммы хранятся и поддерживаются на заданном уровне во ВГНКЙ ветеринарных препаратов. Эти штам­мы, в свою очередь, являются производственными, поскольку на их основе готовятся вакцины. При этом инактивированные вакцины, как правило, готовятся из высоковирулентных штаммов, а живые вакцины - из аттенуированных (ослабленных), авирулентных штаммов.

Наряду с производственными и эталонными штаммами во ВГНКИ хранятся контрольные штаммы, которые используют для оценки каче­ства вакцинных препаратов. Эти штаммы должны быть генетически однородными популяциями микроорганизмов со стабильными морфо­логическими, специфическими и биологическими свойствами. Основ­ными требованиями к этим штаммам являются их высокие антигенные и иммуногенные свойства.

Антигенные свойства штаммов оцениваются по титру антител в сыворотке крови чувствительных животных через определенные сроки после введения им микроорганизмов.

Иммуногенньхе свойства штаммов определяются по устойчиво­сти привитых животных к заражению возбудителем болезни опреде­ленной дозой контрольного (вирулентного) штамма и выражают 50%-ной дозой иммуногенности или по нарастанию титра антител в сыво­ротке крови. При этом 80% привитых животных должны быть невос­приимчивы к инфекции, против которой их вакцинировали.

Безвредность (реактогенность) эталонного, производственного штамма проверяют по выраженности реакции у лабораторных и есте­ственно-восприимчивых животных на 5-10-кратное увеличение приви­вочной дозы.

Производственные, эталонные штаммы, должны сохранять генети­ческую стабильных антигенных, иммуногенных и других присущих им биологических свойств на протяжении 10-20 последовательных пере­севов как in vivo, так и in vitro.

1.2. ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПОСЕВНОЙ МИКРОБНОЙ КУЛЬТУРЫ

Обычно производственное культивирование микроорганизмов при изготовлении вакцин осуществляют в больших объемах. Поэтому вна­чале из имеющегося эталонного штамма микроорганизма, находяще­гося, как правило, в лиофильно высушенном состоянии в ампуле, де­лают посевы в небольшие емкости, например во флаконы емкостью 100-200 см³, заполненные по 50-150 мл производственной средой. За­тем из флаконов делают высевы в большие емкости - бутыли объемом 18-20 литров.

При хорошем накоплении микроорганизмов такую культуру вно­сят в реактор и называют посевной (матрацной, матровой, маточной). При этом нужно предварительно рассчитать необходимое количество посевной культуры для производственного культивирования микроор­ганизмов, исходя из посевной дозы, которая обычно составляет от 1 до 10 % по объему. Посевные микробные культуры также контролиру­ются на сохранение ими типичных морфологических, культурально-биохимических, антигенных и иммуногенных свойств и отсутствие в них посторонней микрофлоры (ПМФ).

1.3. ПРИГОТОВЛЕНИЕ И СТЕРИЛИЗАЦИЯ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД

  Одним из этапов получения биопрепаратов является культивирова­ние микроорганизмов, которое невозможно без достаточного количе­ства разнообразных стандартных, эффективных и недорогих питатель­ных сред (ПС).

  В этой связи представляется целесообразным рассмотреть основ­ные принципы, лежащие в основе конструирования ПС, к которым относятся:

  - удовлетворение питательных потребностей микроорганизмов;

  - выбор сырьевых источников для конструирования ПС;

  - дифференциация ПС по целевому назначению;

      - оптимизация ПС;

    - стандартизация ПС.

Познавательные статьи:



Техника нижней прямой подачи мяча

Комплекс физических упражнений для развития мышц плечевого пояса

Стандарт Порядок надевания противочумного костюма

Общеразвивающие упражнения без предметов