Методы генетической трансфекции в генной терапии

↑

▷ Содержание

⇐ ПредыдущаяСтр 13 из 16Следующая ⇒

Решающим условием успешной генной терапии является обеспечение эффективной доставки, т.е. трансфекции (в широком смысле) или трансдукции (при использовании вирусных векторов) чужеродного гена в клетки-мишени, обеспечение длительной персистенции его в этих клетках и создание условий для полноценной экспрессии. Существуют следующие основные подходы к трансфекции клеток:

1) трансфекция "чистой" ДНК, лигированной в соответствующую плазмиду;

2) трансфекция комплексированной ДНК, т.е. - плазмидной ДНК, находящейся в комплексе с солями, белками (например, трансферрином), органическими полимерами (ДЭАЭ-декстраном, полилизином), липосомами или частицами металлов (золото, вольфрам);

3) трансдукция ДНК в составе вирусных частиц, предварительно лишенных способности к репликации;

Условием длительной персистенции чужеродной ДНК в клетках-реципиентах является ее встраивание в геном клетки-хозяина. Пребывание чужеродной ДНК в ядре клетки в свободном состоянии (в виде эписом) неизбежно ведет к ее элиминации даже в неделящихся клетках и, соответственно, к ее транзиторной (временной, обычно в течение нескольких месяцев) экспрессии. Необходимой предпосылкой экспрессии чужеродной ДНК является наличие соответствующих промоторов. В случае наличия тканеспецифических промоторов можно добиться экспрессии введенного гена только в определенных тканях и клетках. Методы доставки чужеродных генов в клетки подразделяются на физические, химические и биологические.

Реальная интеграция чужеродной ДНК в геном клетки-реципиента может быть достигнута только с использованием ретровирусных и аденоассоциированных векторов.

Коструирование векторных систем для трансфекции клеток человека

Основные векторные системы

Как правило, вводимый генетический материал представляет собой полноразмерную последовательность кДНК определенного гена, инсертированную в экспрессионный вектор и находящуюся под контролем сильного промотора. Выбор подходящего промотора зависит от многих параметров, главным из которых является необходимый уровень экспрессии в клетках-мишенях. Вектор часто содержит один из маркерных генов (neo, β-Gal, ген люциферазы), присутствие которых в трансдуцированных клетках может быть легко обнаружено. Существует 2 типа векторных конструкций:

1) на основе плазмидной ДНК;

2) на основе вирусов;

Плазмидные конструкции удобны для клонирования, генно-инженерных манипуляций, а также получения большого количества рекомбинантной ДНК. Однако, бактериальные плазмиды, в отличие от вирусных конструкций, не способны самостоятельно проникать в эукариотические клетки. Для введения инсертированной в плазмиду экзогенной ДНК в клетки человека необходимо перенести ее в подходящий вирусный вектор или применить способ, облегчающий ее прохождение через клеточные мембраны.

Познавательные статьи:



Формы дистанционного обучения

Передача мяча двумя руками снизу

Значение правильной осанки для жизнедеятельности человека

Основные ошибки при выполнении передач мяча на месте