Биологические свойства возбудителя чумы

· Изучение характера роста культуры на скошенном агаре.

· Изучение морфологии микробов в мазках, приготовленных из агаровой культуры, и в мазках-отпечатках органов грызунов, павших от чумы. Окрашивание мазков по Граму и синькой Леффлера. Постановка пробы с 3 % КОН.

· Посев каждой культуры на 3 чашки питательного агара (ПА), 2 чашки агара с генцианвиолетом, в пробирки с 0,3 % питательным агаром, средами Гисса с глюкозой, лактозой, сахарозой, глицерином, рамнозой, арабинозой, маннитом, мальтозой, со средой Кристенсена, цветной дифференциальной средой (ЦДС), в питательный бульон (ПБ), ПБ с KN0₃, в пробирки со скошенным питательным агаром.

· Определение пестициногенной активности (приложение).

· Посев культуры возбудителя чумы и возбудителя псевдотуберкулеза на чашку 1,5 % питательного агара с генцианвиолетом бляшками диаметром 0,5-1,0.

Примечания:

- посев на ПА поместить при 28 °С, 37 °С и при комнатной температуре;

- посевы на агаре с генцианвиолетом - при 28 °С и при комнатной температуре;

- посев на 0,3% ПА - в шкаф при комнатной температуре;

· Изучение морфологию формирующихся колоний на ПА, ПА с генцианвиолетом.

· Изучение морфологии роста культур в бульоне.

· Приготовление мазков из агаровой и бульонной культур, окрашивание по Граму и синькой Леффлера.

· Определение подвижности на 0,3 % ПА.

· Изучение ферментации углеводов и спиртов на средах Гисса, уреазной активности на среде Кристенсена и ЦДС (приложение).

· Изучение фаголизабельности.

· Постановка пробы на чувствительность к бактериофагам Л-413С, Покровской, псевдотуберкулезному методом «стерильного пятна».

· Постановка пробы на чувствительность к бактериофагам Л-413С, Покровской, псевдотуберкулезному двухслойным методом (приложение).

· Постановка пробы на чувствительность к бактериофагу Покровской методом дифференциального рабочего титра (приложение).

· Постановка пробы на чувствительность к бактериофагу Л-413С ускоренным методом.

· Посев культуры в пробирки со скошенным питательным агаром.

• Изучение морфологии 2-х суточного роста возбудителей чумы и псевдотуберкулеза на ПА, ПА с генцианвиолетом.
• Изучение морфологии роста культур в бульоне через 48 ч.
• Регистрация ферментации углеводов и спиртов на средах Гисса.
• Определение фибринолитической и коагулазной активности (приложение).
• Посев культуры возбудителя чумы на пластинчатый и скошенный ПА с кровью.
• Посев культуры на скошенный ПА.
• Изучение фаголизабельности.
• Учет пробы с фагами.
• Определение пестициногенной активности (приложение).

Примечание: инкубирование посевов с кровью на ПА при 37 °С.

• Учет пробы на фибринолизин и коагулазу.
• Постановка пробы на нитриты с реактивом Грисса.
• Определение пестициногенной активности.
• Регистрация зоны задержки роста индикаторного штамма возбудителем чумы.
• Изучение вирулентности чумного микроба на специальных питательных средах.

Рост на среде Джексона-Берроуза

На поверхность среды с гемином или ДАС нанести 0,1 мл взвеси односуточной агаровой культуры, содержащей 5х10³ м.к./мл, и распределить шпателем по поверхности агара. Посевы инкубировать 4-5 сут. при 28 °С. Вирулентные бактерии чумы вырастают в виде бурых колоний на среде с гемином, темно-красных или темно-синих на ДАС (Psb)⁺. Бактерии, утратившие вирулентность, образуют бесцветные колонии (Psb)^-.

Рост на среде Хигучи-Смита и питательной среде для определения потребности чумного микроба в ионах кальция сухой (ВМ)

Для исследования на среде Хигучи-Смита и ВМ из односуточной агаровой культуры готовят взвеси, содержащие 10³ или 2х10³м.к./мл. Из каждого разведения по 0,1 мл высевают на чашки со средой. Посевы инкубируют при 37 °С. Через 48 ч отмечают колонии I порядка (бактерии, независимые от ионов кальция, авирулентные). Через 24 ч дополнительной инкубации при той же температуре регистрируют колонии II порядка, состоящие из авирулентных иммуногенных клеток. Затем посевы помещают при 28 °С и подсчитывают вновь появившиеся колонии, состоящие из вирулентных клеток. В качестве контроля 100 или 200 м.к. высевают на агаровые пластины с 1 % дефибринированной крови барана или кролика при использовании среды Хигучи-Смита или питательный агар для выращивания чумного микроба-при работе со средой ВМ.

• Посев суточной культуры возбудителя чумы на среду ВМ с контролем и Джексона-Берроуза или ДАС для выявления вирулентных и авирулентных клеток.
• Изучение антигенной структуры возбудителя чумы. Определение фракции I чумного микроба.
• Определение 2 сывороточных единиц (СЕ) противочумной сыворотки.
• Приготовление микробной взвеси 10⁹ м.к./мл на 2 % растворе формалина из культуры возбудителя чумы, выращенной на ПА с кровью при 37 °С.
• Контрольный высев через 1 ч из обработанной формалином взвеси на чашку ПА.

Примечание: инкубация посевов на среде ВМ и контроля - при 37 °С, на среде Джексона-Берроуза - при 28°С.

• Изучение антигенной структуры. Определение F1 чумного микроба.
• Люминесцентно-серологический метод.
• Серологические реакции с применением эритроцитарных диагностикумов (РПГА, РНАт).

• Изучение вирулентности возбудителя чумы на специальных средах.
• Регистрация всех колоний (I - II порядка), выросших на среде ВМ при 37 °С в течение 42-48 ч, сравнение с ростом на контрольной чашке. Инкубация посевов при 28 °С.

· Выявление ДНК (pFra и pPst) Y.pestis методом полимеразной цепной реакции.

· Подготовка пробы - микробной взвеси 10⁴ м.к./мл.

· Постановка ПЦР:

ГенПест тест-система предназначена для выявления ДНК возбудителя чумы в исследуемом материале методом ПЦР.

Для детекции Y. pestis подобрана система, состоящая из двух пар праймеров, выбранных на основе двух собственных плазмид чумного микроба pFra и pPst. Первая пара праймеров, соответствующих нуклеотидной последовательности гена pla (плазмида pPst), обеспечивает амплификацию фрагмента 478 п.н., вторая пара праймеров F21-F22, комплементарных участку гена caf (плазмида pFra), амплифицирует фрагмент - 295 п.н.

В состав тест - системы входят следующие компоненты: деионизованная вода,10 х буфер, дНТФ, plaY 1 – праймер, plaY 2 – праймер, F 21 - праймер, F 22 – праймер, фермент Taq - полимераза, контрольная ДНК, масло вазелиновое.

Набор хранится при температуре -20°С. Срок хранения не более 6 месяцев.

Объектом для исследования может быть клинический материал, объекты внешней среды, органы животных, а также клеточные взвеси при идентификации выделенных культур. При работе с клиническим материалом и загрязненными объектами внешней среды необходим предварительный этап подготовки проб (выделение ДНК). Подготовку проб осуществляют с помощью поставляемого отдельно набора и прилагаемой к нему инструкции.

При работе с микробными взвесями (10⁹ м.к./мл) возможна их обработка мертиолатом натрия (0,01 %) с последующим прогреванием при 56 °С в течение 30 мин для обеззараживания. Разведения чистых культур из 10⁹ м.к./мл до 10⁴~ 10⁶ м.к./мл следует готовить на бидистиллированной воде, поскольку хлорид натрия, входящий в состав физиологического раствора, является ингибитором ПЦР.

Для проведения ПЦР готовят необходимое количество 0,6 мл микропробирок, соответствующее числу исследуемых проб, а также еще три пробирки - для приготовления реакционной смеси, положительного и отрицательного контролей. Затем извлекают тест-систему из морозильной камеры, размораживают содержимое пробирок (для этого лучше использовать ледяную баню). После транспортировки или длительного хранения пробирки центрифугируют на микроцентрифуге 20 сек (для осаждения капель со стенок) и тщательно перемешивают на вортексе. После этого готовят реакционную смесь в специально предназначенной для этого микропробирке из расчета на одну пробу: деионизованной воды - 5,8 мкл, 10х буфера – 2,5 мкл, дНТФ - 2,5 мкл праймеров - по 1 мкл каждого и фермента Taq - полимеразы - 0,2 мкл. Фермент в реакционную смесь вносят в последнюю очередь и оставляют его вместе с наконечником в микропробирке. Затем в этот наконечник вставляют дозатор, настроенный на 15 мкл, тщательно перемешивают реакционную смесь не только круговыми движениями наконечника, но и поступательными движениями поршня дозатора (пипетированием). По окончании перемешивания добавляют по 15 мкл реакционной смеси в каждую микропробирку, включая контроли, после чего раскапывают минеральное масло. Минеральное масло вносят по одной капле из 1 мл наконечника микродозатора для предотвращения испарения реакционной смеси при термоциклировании. После этого в пробирку, обозначенную как отрицательный контроль, вносят 10 мкл деионизованной воды, а в пробирку, обозначенную как положительный контроль, - 10 мкл контрольной ДНК (контрольную ДНК необходимо вносить специально предназначенным для этого микродозатором!). Пробы в объеме 10 мкл вносят (также предназначенным для этого микродозатором) под минеральное масло. По мере заполнения пробирки закрывают, нумеруют, помещают в амплификатор и проводят термоциклирование по следующей матричной программе:

94°------------3 мин х 1 цикл

94°-----------40 сек!

58°-----------40 сек! 35 циклов

72°-----------40 сек!

72°------------3 мин х 1 цикл

10°-----------хранение

Учет результатов. Продукты, полученные в ПЦР, анализируют методом электрофореза в 1,5–2 % агарозе с добавлением бромистого этидия. Агарозу готовят на 1х ТАЕ буфере, который готовят из 50-кратного, путем разведения в 50 раз (состав 1 литра 50- кратного ТАЕ буфера: 242 г триса, ледяная уксусная кислота - 57 мл, 0,5 М раствор ЭДТА - 100 мл, бромистый этидий - 0,5 мкг/мл, рН 8,0). Доведенную до кипения и охлажденную до 50 °С агарозу заливают в специальную ванночку, устанавливают гребенку и оставляют застывать при комнатной температуре. После полимеризации осторожно извлекают гребенку и переносят гель в камеру для проведения электрофореза. Затем к амплификату добавляют 4-5 мкл смеси, состоящей из 0,25 % бромфенолового синего и 25 % фиколла-400, приготовленной на дистиллированной воде, перемешивают при помощи того же наконечника и вносят в карманы геля. По окончании камеру подключают к источнику тока и задают напряжение 10-15 в/см. Электрофоретическое разделение продолжают в течение 25-35 мин до прохождения лидирующего красителя около 2/3 длины трека (рекомендуемая длина трека - 4 см), после чего извлекают гель из камеры и помещают на стекло трансиллюминатора с УФ излучением 310 нм.

Внимание! С гелем агарозы следует работать в перчатках, поскольку бромистый этидий является мутагеном.

Оценка результатов ПЦР:

1. Положительный контроль - выявляются две специфичных полосы размером 478 п.н. и 295 п.н.

2. Отрицательный контроль: полосы на уровне положительного контроля должны отсутствовать, наличие полос свидетельствует о контаминации тест-системы.

3. Анализируемые пробы: наличие одной или двух полос строго на уровне положительного контроля указывает на присутствие ДНК данного возбудителя.

4. Наличие полос, располагающихся выше или ниже контрольных, является неспецифичным ответом и во внимание не принимается.

5. Полученные результаты можно документировать с помощью видеосистемы или фотографированием геля с использованием оранжевого или интерференциального (594 им) светофильтра.

Чувствительность метода – не менее 1000 геномов Y. pestis в 1 мл.

• Изучение многосуточного роста возбудителей чумы и псевдотуберкулеза на плотных и жидких питательных средах.
• Приготовка и просмотр окрашенных по Граму мазков с агаровой и бульонной культур.
• Регистрация ферментации углеводов и спиртов на средах Гисса.
• Изучение потребности штаммов чумного микроба в аминокислотах.
• Изучение вирулентности возбудителя чумы на специальных средах.
• Подсчет вновь появившихся колоний (III порядка) на среде ВМ, сравнение с ростом на контрольной чашке.
• Обеззараживание посевов.
• Окончательный учет РПГА и РНАт.

• Подсчет количества вирулентных и авирулентных клеток на среде Джексона-Берроуза или ДАС.
• Обеззараживание посевов.

• Изучение потребности чумного микроба в аминокислотах.
• Учет результатов. Обеззараживание посевов.