Внимание: соблюдать меры безопасности при работе с кипящей водяной баней.

↑

▷ Содержание

⇐ ПредыдущаяСтр 2 из 6Следующая ⇒

ХОД РАБОТЫ:

1. Наливают в 4 пробирки по 0,5 мл раствора крахмала. Еще в 4 пробирки наливают по 0,5 мл разбавленной (1:10) слюны.

2. Берут первую пару пробирок (одна с ферментом, другая с крахмалом) и помещают на баню со льдом. Вторую пару оставляют при комнатной температуре. Третью пару пробирок помещают в термостат (40 градусов), а четвертую - в кипящую водяную баню.

3. Через 10 мин содержимое каждой пары пробирок сливают вместе, тщательно перемешивают и оставляют стоять еще 10 мин в тех же условиях.

4. Из 3-й пробирки отбирают 3 капли жидкости и проделывают реакцию с каплей йода на стекле. Если появляется синее окрашивание, растворы оставляют стоять еще 10 мин, и после этого повторяют реакцию с йодом на стекле. Затем добавляют 2 капли раствора йода во все пробирки и наблюдают за появлением окрашивания.

ВЫВОД (записать полученный результат и дать ему клинико-диагностическую оценку):

Влияние активаторов и ингибиторов на активность амилазы.

ХОД РАБОТЫ:

1. В одну пробирку вносят 10 капель дистиллированной воды, а во 2-ю - 8 капель воды и 2 капли 1% раствора хлорида натрия в 3-ю - 8 капель воды и 2 капли раствора сульфата меди.

2. В каждую пробирку добавляют по 20 капель разведенной слюны (1:10), пробирки перемешивают, добавляют по 5 капель раствора крахмала и оставляют стоять при комнатной температуре 5 мин.

3. Тем временем готовят 3 пробирки с водой (по 1 мл) подкрашенной каплей раствора йода, и добавляют в них по 3 капли содержимого опытных проб. Наблюдают окрашивание в зависимости от степени расщепления крахмала амилазой. В 1-ой пробирке появляется фиолетовая или красно- бурая окраска, во второй пробирке, где ионы хлора играют роль активатора, появляется желтая окраска, а в 3-ей пробирке, где ионы меди тормозят действие амилазы, окраска остается синей. Если описанная картина не наблюдается, то опыт повторяют через 10-15 минут.

ВЫВОД (записать полученный результат и дать ему клинико-диагностическую оценку):

Влияние pH на активность амилазы слюны.

Оптимум pH для действия амилазы слюны можно определить при взаимодействии ее с крахмалом при различных значениях pH среды. О степени расщепления крахмала можно судить по реакции крахмала с йодом в течение времени. При оптимальном значении pH расщепление крахмала произойдет полностью (окраска с йодом отсутствует). По мере удаления от точки pH в кислую или щелочную сторону произойдет лишь частичное расщепление крахмала до стадии декстринов (красно-бурая или фиолетовая окраска) или крахмал вообще расщепляться не будет (синяя окраска).

ХОД РАБОТЫ:

1. В 4 пронумерованные пробирки отмеривают отдельными пипетками по 2 мл фосфатного буфера с различным значением pH (2,0; 4;0, 6,8; 9,0).

2. В каждую пробирку добавляют по 1 мл раствора крахмала и по 0,5 мл разбавленной (1: 10) слюны, которые помещают в термостат на 10 мин при 38° С.

3. Из каждой пробирки каплю жидкости смешивают с каплей раствора йода на предметном стекле и сравнивают окрашивание в каждой пробирке. Повторяют эту пробу через 1-2 мин до тех пор, пока проба из 5 пробирки даст с йодом на стекле красно-бурое окрашивание. Через 1-2 мин после этого во все пробирки добавляют по 2-3 кап раствора йода (начинать с 1 пробирки). Содержимое пробирок хорошо взбалтывают. Сравнивают между собой окрашивание во всех пробирках и делают вывод о степени расщепления крахмала, а, следовательно, об активности фермента при этом значении pH среды.

ВЫВОД (записать полученный результат и дать ему клинико-диагностическую оценку):

ЗАНЯТИЕ 4

ТЕМА: Ферменты 3. Номенклатура и классификация ферментов. Медицинская энзимология.

Цель занятия: Сформировать представления о принципах номенклатуры и классификации ферментов, основных аспектах и проблемах медицинской энзимологии. Научиться определять активность амилазы в моче.

Исходный уровень знаний и навыков:

Студент должен знать:

1. Строение клетки и основных органелл

2. Понятие о мутациях и механизмах мутагенеза Основные этапы биосинтеза белка

3. Принципы и методы измерения скорости химических реакций

Студент должен уметь:

1. Выполнять качественные реакции на активность ферментов биологических жидкостей.

Структура занятия:

1. Теоретическаячасть:

1.1. Локализация ферментов в клетке (клеточная мембрана, цитоплазма, митохондрии, ядро, лизосома, рибосомы). Маркерные ферменты. Органоспецифические ферменты. Выделение и очистка ферментов. Качественное обнаружение и количественное определение. Единицы измерения количества и активности ферментов. Номенклатура и классификация.

1.2. Изоферменты, их биологическая роль. Полиферментные комплексы. Понятие о метаболоне.

1.3. Изменение активности ферментов в онтогенезе.

1.4. Основные направления клинической энзимологии.

1.4.1. Энзимопатии. Определение. Классификация. Первичные (наследственные) энзимопатии. Причины возникновения. Механизм развития метаболических нарушений при энзимопатиях. Степень клинических проявлений энзимопатий. Вторичные (приобретенные) - токсические, алиментарные энзимопатии. Причины возникновения. Механизм развития метаболических нарушений. Клинические проявления.

1.4.2. Энзимодиагностика, принципы и объекты энзимодиагностики (кровь, моча, слюна, ликвор, пот, и др.). Характеристика основных ферментов сыворотки крови (клеточные, секреторные и экскреторные). Типы изменения активности ферментов при патологии (гипо-, гипер- и дисферментемия). Задачи энзимодиагностики.

1.4.3. Энзимотерапия. Использование ферментов для заместительной терапии. Лечение хирургических, сердечно- сосудистых и онкологических заболеваний. Иммобилизованные ферменты. Липосомы и их применение.

1.4.4. Использование ферментов в лабораторной практике для определения концентрации субстратов и активности ферментов.

1.4.5. Использование ферментов в промышленности и производстве.

2. Практическая часть (выполнение лабораторной работы):

2.1. Количественное определение активности амилазы мочи по Вольгемуту.

3. Решение задач и проведение контроля конечного уровня

Литература основная:

1. 1. Материал лекций

2. Березов Т. Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия, М., Медицина, 1990, стр. 126-132, М., Медицина, 1998, стр. 157-168.

3. 3. Николаев А. Н. Биологическая химия, М., Высшая школа, 1989, стр. 52-92.

дополнительная:

4. 4. Р. Марри и др. "Биохимия человека", М., Мир, 1.1993, том 1, стр. 63-75.

5. 5. Филиппович Ю. Б. "Основы биохимии" М., Высшая школа, 1993, стр. 105-144.

6. 6. Ташев Т (ред.). Врожденные и приобретенные энзимопатии. М., Медицина, 1980.

7. 7. Вилкинсон Д. Принципы и методы диагностической энзимологии. М., Медицина, 1981.

8. 8. Руководство по клинической лабораторной диагностике. Киев, Выща школа, 1990, стр. 167-186

9. 9. Зилва Ф., Пеннел Дж. Клиническая химия в диагностике и лечении. М., Медицина, 1986, стр.372-388.

ЗАДАЧИ

1. Изоферменты ЛДГ различаются по:

2. Какие из свойств ферментов плазмы крови можно использовать с целью диагностики?

а) молекулярную массу и его электрофоретическую подвижность

б) значение K_m для субстратов

в) чувствительность к действию активаторов и ингибиторов, а также к условиям среды.

г) энергию активации

д) оптимум pH

3. О каких заболеваниях свидетельствует увеличение активности перечисленных ферментов в плазме крови?

4. Ингибиторами каких ферментов являются указанные соединения:

5. В структуру каких ферментов входят соединения?

Практическая часть:

Лаборатоpная работа № 1: Количественное определение активности амилазы мочи по Вольгемуту.

ПРИНЦИП МЕТОДА: Определение активности амилазы в биологических жидкостях (моча, ликвор, слюна, сыворотка крови) основано на определении минимальной активности (количества) фермента, катализирующего в стандартных условиях гидролиз добавленного крахмала. Амилазная активность мочи выражается количеством мл крахмала, которое расщепляется ферментом, содержащимся в 1 мл неразведенной мочи, при температуре 45ºC за 15 минут.

ХОД РАБОТЫ: Берут 10 пронумерованных пробирок и приливают в каждую по 1 мл физиологического раствора. Затем в 1-ю пробирку добавляют 1 мл исследуемой мочи. Содержимое этой пробирки перемешивают, несколько раз втягивая и выпуская жидкость из пипетки. Набирают в пипетку 1 мл смеси и переносят во 2-ю пробирку и процедуру повторяют вплоть до 10-й пробирки. Из 10 пробирки 1 мл смеси отбрасывают. При этом получается следующее разведение мочи (см. табл.).

В каждую пробирку добавляют по 1 мл физраствора и по 2 мл 0,1% раствора крахмала. После перемешивания содержимого, пробирки термостатируют 15 мин при температуре 45°С. После инкубации пробирки охлаждают водопроводной водой и ставят в штатив по порядку. Прибавляют в каждую пробирку по 1 капле раствора йода и перемешивают. Отмечают пробирку с наибольшим разведением мочи, при котором произошло полное расщепление крахмала с йодом. Полученные данные заносят в таблицу:

Расчет: Предположим, что полный гидролиз крахмала произошел в первых 4-х пробирках. В четвертой пробирке (где разведение мочи 1:16), 1/16 мл мочи гидролизует 2 мл 0,1% крахмала, значит 1 мл неразведенной мочи расщепит 32 мл 0,1% крахмала. Следовательно, активность амилазы мочи равна 32 единицы. В норме активность амилазы мочи равна 16-64 единицы.

Клинико-диагностическое значение.

Определение активности амилазы мочи и сыворотки крови широко используется в клинической практике для диагностики заболеваний поджелудочной железы. При острых панкреатитах амилазная активность мочи и сыворотки крови увеличивается в десятки раз, особенно в первые сутки заболевания, а затем постепенно возвращается к норме. При почечной недостаточности амилаза в моче отсутствует. В детском возрасте увеличение активности амилазы наблюдается при эндемическом паротите, что указывает на одновременное поражение поджелудочной железы вирусом паротита.

ВЫВОД (записать полученный результат и дать ему клинико-диагностическую оценку):

ЗАНЯТИЕ 5

ТЕМА: Биологическое окисление 1. Цикл Кребса.

Цель занятия: Сформулировать современные представления о путях и механизмах получения, депонирования и утилизации энергии в живых организмах.

Исходный уровень знаний и умений:

Студент должен знать:

1. Элементы химической термодинамики. Первый и второй законы термодинамики. Энергия Гиббса.

2. Суть и механизм окислительно-восстановительных реакций.

3. Строение коферментов NAD⁺, NADP⁺, FAD⁺ их роль и механизм участия в окислительно-восстановительных реакциях.

Студент должен уметь:

1. Выполнять качественные реакции на субстраты энергетического обмена.

Структура занятия:

1. Теоретическая часть:

1.1. История развития учения о биологическом окислении (БО). Взгляды А. Лавуазье, М.В. Ломоносова, Ф. Шейнбайна, А.Н. Баха, К. Энглера, В.И. Палладина, Г. Виланда.

1.2. Теория перекисных соединений Баха - Энглера, ее суть и критический анализ.

1.3. Теория Палладина - Виланда, ее суть и критический анализ.

1.4. Дальнейшее развитие учения о биологическом окислении. Современные представления о биологическом окислении. Принципы преобразования и передачи энергии в живых системах. Окислительно-восстановительные реакции, окислительно-восстановительный потенциал. Макроэргические соединения, строение АТФ, причины макроэргичности.

1.5. Субстраты биологического окисления. Схема образования субстратов из углеводов, липидов, белков. Этапы биологического окисления - цитоплазматический и митохондриальный. Ферменты, коферменты биологического окисления - NAD⁺, NADP⁺, FAD и FMN зависимые дегидрогеназы.

1.6. Строение и функции митохондрии. Сравнительная характеристика мембран митохондрий. Ферментный состав различных компартментов.

1.7. ЦТК - цикл трикарбоновых кислот (Кребса), как общий конечный пункт утилизации субстратов биологического окисления. История открытия. Последовательность реакций, ферменты, коферменты. Субстратное фосфорилирование. Регуляция ЦТК. Значение ЦТК (пластическая, энергетическая и регуляторная роль).

1.8. Витамины PP, B₂. Строение и роль в энергетическом обмене.

2. Практическая часть - выполнение лабораторных работ:

2.1. Открытие субстратов ЦТК (лимонной и янтарной кислот).

2.2. Качественное обнаружение цитохромоксидазы.

3. Решение задач и проведение контроля конечного уровня

Литература основная:

1. Материал лекций

2. Березов Т. Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия, М., Медицина, 1990, стр. 213-220, М., Медицина, 1998, стр. 223-226, 345-353.

3. Николаев А. Н. Биологическая химия, М., Высшая школа, 1989, стр. 199-221.

дополнительная:

4. 4. Р. Марри и др. "Биохимия человека", М., Мир, 1993, том 1, стр. 111-126, 172-177.

5. 5. Ленинджер А. Основы биохимии, 1985, том 2, стр. 477-507.

ЗАДАЧИ:

1. БО у высших организмов сопряжено с:

2. В митохондриях:

3. Какие из этапов ЦТК обеспечивает наибольший выход АТФ:

4. При окислении 1 г жира образуется больше энергии, чем при распаде углеводов и белков, потому что:

а) липиды образуют большее количество ацетил-КоА, чем необходимо для ЦТК

б) ткани, утилизирующие липиды выделяют больше тепла, чем ткани, утилизирующие углеводы.

в) атомы углерода в липидах "более восстановлены", чем в белках и углеводах.

г) окислительный метаболизм липидов протекает более полно

д) молекулярный вес липидов больше, чем углеводов.

5. Какой из следующих биологических процессов потребляет наибольшее количество энергии?

6. Какие из указанных соединений являются макроэргическими:

Практическая часть:

Лаборатоpная работа № 1. Открытие некоторых субстратов ЦТК (лимонной и янтаpной кислот)

ПРИНЦИП МЕТОДА: Ди- и трикарбоновые кислоты, карбоксильные группы которых расположены рядом при взаимодействии с резорцином и конц. серной кислотой образуют флюоресцирующие в ультрафиолетовом свете продукты.

Познавательные статьи:



Где возникла философия и почему?

Относительная высота сжатой зоны бетона

Сущность проекции Гаусса-Крюгера и использование ее в геодезии

Тарифы на перевозку пассажиров