Дослід 1. Визначення активності аланінамінотрансферази (АлАТ) уніфікованим динітрофенілгідразиновим методом Райтмана-Френкеля.

↑

▷ Содержание

⇐ ПредыдущаяСтр 11 из 12Следующая ⇒

Принцип методу. У результаті реакції трансамінування під дією АлАТ утворюються піруват і глутамат. При додаванні 2,4-динітрофенілгідразину в лужному середовищі утворюється гідразон піровиноградної кислоти червоно-бурого забарвлення, інтенсивність якого прямопропорційна кількості утвореної піровиноградної кислоти і є показником активності АлАТ.

Матеріальне забезпечення: 0,1 М розчин Na₂HPO₄; 0,1 М розчин КН₂РО₄; 0,1 М фосфатний буфер рН 7,4; 0,4 М розчин NаОН; 0,04 % розчин бромтимолового синього; субстратний розчин (29,2 мг α-кетоглутарової кислоти і 1,78 мг D,L-аланіну розчиняють в 1 М NаОН до отримання рН 7,4, розчин переливають у мірну колбу на 100 мл і доводять 0,1 М фосфатним буфером до мітки); 1 М розчин хлоридної кислоти; 1 мМ розчин 2,4-динітрофенілгідразину; натрію піруват. Визначення проводять за допомогою спектрофотометра або фотоелектроколориметра. Необхідні термостат або водяна лазня, холодильник.

Приготування калібрувального розчину: 11 мг натрію пірувату розчиняють у невеликій кількості води, переносять у мірну колбу на 100 мл і доводять водою до мітки: 1 мл калібрувального розчину містить 110 мкг натрію пірувату, що відповідає 88 мкг або 1 мкмоль піровиноградної кислоти.

Хід роботи. 1) Дослідна проба: у пробірку вносять 0,5 мл субстратного розчину і 0,1 мл досліджуваної сироватки. Пробірку ставлять у термостат при 37⁰С на 30 хв. Додають 0,5 мл розчину 2,4-динітрофенілгідразину і витримують 20 хв. при кімнатній температурі. Потім додають 5 мл 0,4 М NaOН, перемішують і залишають на 10 хв при кімнатній температурі для розвитку забарвлення. Інтенсивність забарвлення визначають на фотоелектроколориметрі при зеленому світлофільтрі (λ = 546 нм) у кюветі з товщиною шару 10 мм проти контрольної проби.

2) Контрольна проба: у пробірку вносять 0,5 мл субстратного розчину, 0,1 мл сироватки і 0,5 мл розчину 2,4-динітрофенілгідразину і витримують 20 хв. при кімнатній температурі. Потім додають 5 мл 0,4 М NaOН і далі все виконують аналогічно дослідній пробі.

Побудова калібрувального графіка: з калібрувального розчину готують низку розведень (див. табл.). Калібрувальні проби проводять так само як і дослідні, але замість сироватки додають розведені калібрувальні розчини. Вимірюють проти холостої проби, в яку замість калібрувальних розчинів додають воду. Визначивши оптичну густину розчинів будують калібрувальний графік, відкладаючи на осі абсцис активність ферменту, а на осі ординат – значення оптичної густини. Калібрувальна крива лінійна до величини оптичної густини 0,3.

Отримання калібрувальних розчинів:

Кількість утвореної піровиноградної кислоти (у мкг) знаходять за калібрувальним графіком або за формулою І:

Активність АлАТ вираховують за формулою ІІ:

де: Х – кількість піровиноградної кислоти, знайденої за калібрувальним графіком або за формулою І, мкг;

2 – коефіцієнт перерахунку на 1 год інкубації;

10 – коефіцієнт перерахунку на 1 мл сироватки;

88 – маса 1 мкмоль піровиноградної кислоти.

Зробити висновок.

Клініко-діагностичне значення. В організмі людини процес трансамінування активний у печінці, серці, скелетних м’язах, нирках та інших органах. У сироватці крові активність амінотрансфераз дуже низька. При порушенні цілісності клітинних мембран (цитолізі) амінотрансферази проникають із клітин у кров. Тому визначення активності амінотрансфераз у сироватці крові є важливим тестом для діагностики тих захворювань, для яких характерний цитолітичний синдром (інфаркт міокарда, захворювання печінки тощо).

Нормативні величини для трансаміназ сироватки крові: АлАТ (КФ 2.6.1.2) – 0,1 – 0,68 мкмоль/(год.мл) при 37 ^оС, або 4 – 36 МО/л, або 28 – 190 нмоль/(с·л); АсАТ (КФ 2.6.1.1) – 0,1 – 0,45 мкмоль/(год.мл) або 8 – 33 МО/л, або 28 – 125 нмоль/(с·л).

Найвища активність АлАТ характерна для захворювань запального типу, наприклад, захворювань печінки – особливо в інкубаційному періоді інфекційного гепатиту. Активність АсАТ у сироватці крові найвища при захворюваннях некротичного типу - у крові зростає через 4 – 6 год після інфаркту міокарда і звичайно повертається до норми на 3 – 7 день. При стенокардії АсАТ залишається в нормі. Зниження нормальних показників амінотрансфераз у плазмі може бути при недостатності вітаміну В₆, а також при нирковій недостатності.

Діагностично важливим є одночасне визначення активності АлАТ і АсАТ та розрахунок коефіцієнта де Рітіса – АсАТ/АлАТ, який в нормі дорівнює приблизно 1,3. При інфекційному гепатиті він нижчий за норму (за рахунок значного зростання АлАТ), а при інфаркті міокарда – вищий (за рахунок значного зростання АсАТ).

Познавательные статьи:



Алгоритмические операторы Matlab

Конструирование и порядок расчёта дорожной одежды

Исследования учёных: почему помогают молитвы?

Почему терпят неудачу многие предприниматели?